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ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3284—2018猪丹毒丝菌实时荧光PCR检测方法Methodofthereal-timePCRforthedetectionofErysipelothrixrhusiopathiae文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3284—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、巢湖市畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所，同济大学。本标准主要起草人：李郁、李雪松、李春芬、张利亚、陈章、黄晓慧、孙裴、姚焱彬、张劲松、高亚飞、孟天恺。DB34/T3284—20181猪丹毒丝菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪丹毒丝菌实时荧光PCR检测方法的缩略语、试剂和仪器、样品的采集、运输与保存、操作方法。本标准适用于猪组织样品、血样及其细菌培养物中猪丹毒丝菌的实时荧光PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光PCR：荧光聚合酶链式反应Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数DNA：脱氧核糖核酸Taq酶：TaqDNA聚合酶PBS：磷酸盐缓冲液Eppendorf管：微量离心管4试剂和仪器4.1试剂4.1.1无水乙醇:-20℃预冷。4.1.275％乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。4.1.3灭菌双蒸水。4.1.4动物组织基因组DNA提取试剂盒。4.1.5引物：——上游引物：5′-GTGGCGCATATAATCCCGTA-3′——下游引物：5′-GCAAACGCAATGGCTTCT-3′4.1.62×TransTaq-TPCRSuperMix。4.1.7Taq酶。4.1.8实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。4.2仪器DB34/T3284—201824.2.1显微镜：物镜10倍～100倍。4.2.2电子天平：感量0.1g。4.2.3恒温培养箱：36℃±1℃4.2.4冰箱：（2℃～8℃，-20℃，-80℃）。4.2.5微量移液器：0.1µL～2.5µL、0.5µL～10µL、5µL～50µL、20µL～200µL、100µL～1000µL。4.2.6荧光PCR仪。4.2.7恒温水浴锅（室温至100℃）。4.2.8高速台式冷冻离心机：最大转速14000r/min以上。4.2.9全自动快速样品研磨仪。4.2.10混匀器5样品的采集、运输与保存5.1采样要求采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。5.2采样工具5.2.1剪刀、镊子、注射器、1.5mLEppendorf管。5.2.2所有上述采样工具必须经(121士2)℃，15min高压灭菌并烘干。5.3样品的采集5.3.1组织器官根据临床症状的不同采集典型病料。用剪刀、镊子无菌采集肾、脾、肝、心血、淋巴结、疹块及其周围皮肤、肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物等。5.3.2血清或全血用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管，分离血清。或用加有抗凝剂的注射器直接吸取至无菌Eppendorf管，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。5.3.3细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液。对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量菌样，放入0.01mol/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。5.4样品的运输与保存采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。待检样品在2℃～8℃条件下保存不应超过24h；若不能在规定时间内送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，但保存不应超过72h。6操作方法DB34/T3284—201836.1样品前处理6.1.1组织器官样品前处理用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品10mg于研钵中充分研磨，再加5.0mL0.01mol/LpH7.6PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌1.5mLEppendorf管中，编号备用。6.1.2血样、细菌培养物前处理取1mL～2mL全血样品，12000×g离心10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分混匀，12000×g离心10min,弃上清，若红细胞裂解不完全，出现红色沉淀物，则需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，-20℃贮存备用。取1mL～2mL血清、细菌培养物，12000×g离心10min，弃上清；加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混匀，12000×g离心10min，弃上清，收集沉淀物，-20℃贮存备用。6.2核酸（DNA）提取按照动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行。6.3DNA提取后的处理要求提取后的DNA须在2h内进行PCR扩增或置于-80℃贮存备用。6.4荧光PCR扩增反应6.4.1对照设立从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照：——阳性对照：取扩增基因的阳性克隆分子DNA或阳性标准菌株DNA作为阳性对照。——阴性对照：取无交叉反应的非阳性菌株DNA作为阴性对照。——空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。6.4.2扩增试剂准备采用反应体系体积为20μL，含以下成分：2×SYBR®PremixTaqII10μL，ddH2O6.8μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μmol/L）各0.4μL，50×ROXReferenceDye0.4μL，DNA模板2μL。根据上述反应体系、按每个反应18μL的用量配制荧光PCR预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足。将各试剂按使用量吸取到1.5mLEppendorf管中，充分混匀，然后在每个PCR光学管中分装18μL。6.4.3加DNA模板在样品处理区进行。在已分装有荧光PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加入2μL样品或对照的DNA模板，混匀，盖上管盖，放入荧光PCR仪，记录样品放置顺序。6.4.4荧光PCR扩增检测在扩增检测区进行。将6.4.3中加DNA模板后的PCR管放入荧光定量PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。反应参数设置：DB34/T3284—20184——第一阶段：95℃5min，1个循环；——第二阶段：95℃10s，61℃60s,40个循环，荧光收集设置在61℃退火延伸时进行；——第三阶段：55℃30s，95℃30s，1个循环。6.5结果判定见附录B。DB34/T3284—20185AA附录A（规范性附录）缓冲液的配制A.1柠檬酸钠缓冲液A.1.1成分柠檬酸5.3g柠檬酸钠15g葡萄糖16.2g蒸馏水1LA.1.2制法将A.4.1中各成分溶解于蒸馏水，定容至1L，混匀。121℃高压灭菌15min后储存于4℃备用。A.20.5mol/LEDTA缓冲液（pH8.0）A.2.1成分EDTA186.1g蒸馏水1LA.2.2制法称取186.1gEDTA溶解于蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，校正pH至8.0，定容至1L，分装，121℃高压灭菌15min后储存于室温备用。A.30.01mol/LpH7.6PBSA.3.1成分氯化钠4g十二水合磷酸氢二钠1.5g氯化钾0.1g磷酸二氢钾0.1g蒸馏水500mLA.3.2制法将A.2.1中各成分溶解于蒸馏水中，定容至500mL，校正pH至7.6，121℃灭菌20min备用。A.4饱和氯化钠溶液DB34/T3284—20186A.4.1成分氯化钠380～390g蒸馏水1LA.4.2制法称取380～390g氯化钠溶于蒸馏水中，定容至1L。分装于灭菌广口瓶中，每瓶200mL，121℃高压灭菌15min备用。A.530％甘油缓冲盐水溶液A.5.1成分氯化钠5g碱性磷酸钠10g中性甘油300mL蒸馏水1LA.5.2制法先将氯化钠和碱性磷酸钠溶解于蒸馏水中，然后加入中性甘油，混匀，分装于灭菌广口瓶中，每瓶200mL，121℃高压灭菌15min备用。DB34/T3284—20187BB附录B（规范性附录）猪丹毒丝菌荧光定量PCR检测结果判定B.1结果判定B.1.1结果分析条件设定B.1.1.1读取检测结果。B.1.1.2阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。B.1.2质控标准B.1.2.1空白对照：无Ct值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。B.1.2.2阴性对照：无Ct值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。B.1.2.3阳性对照：Ct值≤30并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线。B.1.3结果描述及判定B.1.3.1阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ct值并无明显的扩增曲线和溶解曲线，判为荧光PCR阴性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阴性。B.1.3.2阳性反应结果判定：检测结果呈现Ct值≤30并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线，判为荧光PCR阳性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阳性。B.1.3.3对于30Ct值≤35的样品，需重新取样进行重复扩增。如果重复测结果的Ct值≤35，且出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线，判为阳性反应。否则判为荧光PCR阴性反应。B.1.3.4必要时，对初次检测呈荧光PCR阳性反应的样品进行重复检测。B.1.3.5猪丹毒丝菌实时荧光定量PCR具体检测结果判定见图B.1。DB34/T3284—20188图B.1猪丹毒丝菌实时荧光定量PCR检测结果_________________________________