DB34T 3488-2019 猪链球菌的分子分型MLST 方法

ICS01.120A00DB34安徽省地方标准DB34/T3488—2019猪链球菌的分子分型MLST方法MultilocussequencetypingdetectionmethodforStreptococcussuis文稿版次选择2019-12-25发布2020-01-25实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3488—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽浩翔农牧有限公司提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽浩翔农牧有限公司、安徽冠华农牧有限公司、安徽杜洛克种猪育种有限责任公司、安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、阜阳市动物卫生监督所、怀宁县动物疫病预防与控制中心，巢湖市畜牧兽医局、六安市动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：高亚飞、占松鹤、何长生、谢玉洁、程竹兵、李春芬、程圣芳、段倩倩、李郁、孙裴、袁献宇、刘雪兰、徐小伟、高亚成。DB34/T3488—20191猪链球菌的分子分型MLST方法1范围本标准规定了猪链球菌的分子分型MLST的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、生物安全和防污染措施。本标准适用于猪链球菌的分子分型检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫DB34/T2996猪链球菌检验操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1MLSTmultilocussequencetyping一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。3.2管家基因house-keepinggenes所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是维持细胞生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。4试剂和材料4.1实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.2除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，应用无DNA酶污染的容器分装。4.3细菌基因组DNA提取试剂盒。4.4普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。4.5TaqDNA酶。DB34/T3488—201924.6dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.7引物：猪链球菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列见表1。表1猪链球菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列名称序列（5’→3’）aroA（Forward）TTCCATGTGCTTGAGTCGCTAaroA（Reverse）ACGTGACCTACCTCCGTTGACcpn60（Forward）TTGAAAAACGTRACKGCAGGTGCcpn60（Reverse）ACGTTGAAIGTACCACGAATCdpr（Forward）CGTCTTTCAGCCCGCGTCCAdpr（Reverse）GACCAAGTTCTGCCTGCAGCgki（Forward）GGAGCCTATAACCTCAACTGGgki（Reverse）AAGAACGATGTAGGCAGGATTmutS（Forward）ACTGGGGCATAAGGTCGmutS（Reverse）TGGCTGTCTTAGTTTCGTCrecA（Forward）TATGATGAGTCAGGCCATGrecA（Reverse）CGCTTAGCATTTTCAGAACCthrA（Forward）GATTCAGAACGTCGCTTTGTthrA（Reverse）AAGTTTTCATAGAGGTCAGC4.810×PCR缓冲液：见附录A.1。4.91％琼脂糖凝胶。4.10Gelred核酸染色剂。4.116×溴酚蓝上样缓冲液。4.12分子量标记：1000bpDNAmarker。4.135×TBE电泳缓冲液：见附录A.2。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。4.14质控菌株：猪链球菌。5仪器和设备5.1离心机：转速5000～15000r/min。5.2电子天平：感量0.1g。5.3pH计。5.4涡旋振荡器。5.5PCR仪。5.6电泳仪。5.7凝胶成像仪。5.8基因测序仪。5.9超净工作台5.10移液器：0.1µL～2.5µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL。6操作步骤DB34/T3488—201936.1细菌基因组DNA提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取经过DB34/T2996的方法鉴定为猪链球菌的DNA。6.2MLST基因选择按表2选择猪链球菌的7个管家基因进行MLST分析。表2猪链球菌的管家基因基因名称片段大小bp管家基因名称aroA5655-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因（5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthase）cpn6050760KDa伴侣蛋白基因（60KDachaperonin）dpr466过氧化物抗性基因（peroxideresistance）gki550葡萄糖激酶基因（glucosekinase）mutS618DNA错配修复蛋白基因（DNAmismatchrepairprotein）recA427同源重组因子基因（homologousrecombinationfactor）thrA580天冬氨酸激酶基因（aspartokinase）6.3PCR扩增引物和测序引物合成按表1合成猪链球菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和测序引物。引物使用前稀释到10µmol/L。6.4管家基因片段的PCR扩增反应体系体积为50µL：10×PCR缓冲液5µL、dNTP(2.5mmol/L)4µL、上下游引物各(10µmol/L)1µL、TaqDNA聚合酶(5U/µL)0.5µL、模板DNA5µL、双重蒸馏水补齐至50µL。反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃60s，退火45℃30s，延伸72℃30s，进行35个循环；72℃再延伸10min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在波长为256nm的紫外光下成像观察，出现标准Marker条带和依次单一明亮的条带时（参见附录B图B.1），对相应样品进行PCR产物纯化。6.5PCR产物纯化利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收PCR产物。6.6DNA序列测定按照表1的测序引物，运用Sanger测序法对纯化的PCR产物进行DNA序列双向测序。6.7结果报告将所得到的猪链球菌7个管家基因测序结果上传至MLST网站()进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定猪链球菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组/克隆复合物（clonalcomplex），构建系统遗传进化树作聚类分析（参见附录B图B.2)。DB34/T3488—201947生物安全及防污染措施7.1生物安全措施按照GB19489中的有关规定执行。7.2防污染措施防污染措施应符合GB/T27401的规定。DB34/T3488—20195AA附录A（规范性附录）缓冲液的配制A.110×PCR缓冲液A.1.1成分1mol/LTris-HCl（pH8.3）1.00mL1mol/L氯化钾5.00mL1mol/L氯化镁0.15mL双重蒸馏水3.85mLA.1.2制法将A.1.1中各成分溶解于双重蒸馏水中，混匀，储存于-20℃备用。A.25×TBE电泳缓冲液A.2.1成分Tris54.0g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA(pH8.0）20.0mL蒸馏水补齐至1000mLA.2.2制法将A.2.1中各成分溶解于蒸馏水中，定容至1000mL，混匀，储存于22～25℃备用。DB34/T3488—20196BB附录B（资料性附录）猪链球菌管家基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测按照猪链球菌7个管家基因的扩增引物序列进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在波长为256nm的紫外光下成像观察，出现标准Marker条带和依次单一明亮的条带，见图B.1。图B.1猪链球菌管家基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图系统遗传进化树的构建将所得到的猪链球菌7个管家基因扩增片段进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定猪链球菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为猪链球菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图。数据库中存在的ST型均用一个圆点（黄色）表示，绿色为复合物主要创建者，蓝色表明相应复合物名称，红色表示本试验包含的ST型。图B.2猪链球菌的系统遗传进化树图_________________________________MarkerdprthrAaro-Acpn60gkirecAmutS50010007502000250100