DB35T 1822-2019 水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术

ICS11.220B41DB35福建省地方标准DB35/T1822—2019水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术PCRdiagnostictechniquesfordifferentiatingcircovirusinfectioninwaterfowls2019-04-18发布2019-07-18实施福建省市场监督管理局发布DB35/T1822—2019I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12疫病简述..........................................................................13PCR鉴别诊断.......................................................................1附录A（规范性附录）相关试剂的配制..................................................4附录B（资料性附录）参考序列........................................................6附录C（资料性附录）PCR检测结果电泳图例............................................7DB35/T1822—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业农村厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、江西省萍乡市科学技术情报研究所、宁德海关检验检疫技术中心。本标准主要起草人：傅光华、施少华、黄勇、彭春香、傅秋玲、黄瑜、白泉阳、叶洪、万春和、程龙飞、陈红梅、刘荣昌、陈珍、陈翠腾、朱春华、吴波平、庄晓东。DB35/T1822—20191水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术1范围本标准规定了水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断的操作技术要求。本标准适用于鸭圆环病毒、鹅圆环病毒感染的鉴别诊断。2疫病简述水禽圆环病毒（Waterfowlcircovirus）为圆环病毒科圆环病毒属的成员，主要包括鸭圆环病毒（Duckcircovirus,DuCV）和鹅圆环病毒（Goosecircovirus,GoCV），基因组均为环状单股正链DNA。DuCV可感染不同品种、日龄的鸭，GoCV可感染不同品种、不同日龄的鹅。水禽圆环病毒主要侵害水禽免疫系统，导致宿主免疫应答机能下降，临床上造成被感染动物生长迟缓，并易引起其他细菌和病毒的继发或混合感染。3PCR鉴别诊断3.1仪器设备3.1.1PCR仪。3.1.2台式冷冻离心机（转速不低于12000r/min）。3.1.3微量移液器。3.1.4组织匀浆器。3.1.5电泳仪。3.1.6电泳槽。3.1.7紫外凝胶成像系统。3.2试剂3.2.1蛋白酶K。3.2.210%十二烷基苯磺酸钠（SDS）：配制方法见附录A的A.1。3.2.3Tris饱和苯酚。3.2.4酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。3.2.53mol/L的醋酸钠溶液：配制方法见附录A的A.2。3.2.6无水乙醇。3.2.775%乙醇：配制方法见附录A的A.3。3.2.8溴化乙锭溶液：配制方法见附录A的A.4。3.2.91×TAE缓冲液：配制方法见附录A的A.5。3.2.101.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录A的A.6。3.2.11DNA相对分子质量标准物：100bpladder。3.2.1210×加样缓冲液：配制方法见附录A的A.7。DB35/T1822—201923.3样品的采集与处理样品的采集与处理依照国家采样标准执行，具体如下：无菌采集生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或发病鸭（鹅）的法氏囊、脾脏等器官，剪碎后与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A的A.8）按体积比1：5的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8000r/min离心30min，取上清，用于DNA抽提，或置-20℃冻存备用。若采集的样品需放置6h以上再进行处理，应先置-20℃条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。3.4引物设计根据水禽（鸭、鹅）圆环病毒两个主要蛋白基因3′之间的间隔序列差异设计3条特异性引物：CVF：5′-AAYCWCGCGGGAAGTGGTGGGA-3′；DuCVR：5′-TTCTARGCATAAACGAGATC-3′；GoCVR：5′-ATAMGATTCGGACAATGGACTG-3′。其中，CVF为共用上游引物，CVF与DuCVR用于检测DuCV，扩增条带为554bp大小的基因片段，CVF与GoCVR用于检测GoCV，扩增条带为407bp大小的基因片段。各引物的工作浓度均为10mmol/L，保存于4℃～8℃条件下。3.5样品中病毒DNA提取3.5.1常规DNA提取步骤：3.5.1.1取540μL匀浆液上清，加入60μL10%的SDS，加入蛋白酶K至终浓度5mg/mL，充分混匀15s，56℃水浴2h。3.5.1.2加入等体积Tris饱和苯酚，充分混匀15s，在4℃条件下12000r/min离心15min。3.5.1.3吸取离心后各管中的上清液转移至灭菌管(注意不要吸出中间层)，加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇混合物（混合物中三者比例依次为25:24:1），颠倒混匀15s，静置5min后，在4℃条件下12000r/min离心15min。3.5.1.4重复3.5.1.3步骤1次。3.5.1.5吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液（pH值为5.2）、2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀15s，-20℃沉淀2h。3.5.1.6于4℃条件下，13000r/min离心15min。轻轻倾去上清液，加入800μL75%乙醇清洗沉淀2次，2000r/min离心15s，用无菌枪头吸尽残余液体，室温静置5min。3.5.1.7加入50μL灭菌去离子水重悬，轻轻混匀溶解管壁上的DNA，冰上保存备用。提取的DNA应在2h内进行PCR扩增或保存于-20℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。3.5.2商品化试剂盒DNA提取方法也可采用市售商品化的DNA提取试剂盒，完成样品中病毒DNA的提取。3.6对照分别以鸭圆环病毒、鹅圆环病毒DNA样品作为阳性对照。以番鸭细小病毒或其他病毒（如鸭瘟病毒、产蛋综合征病毒等）DNA样品作为阴性对照。以上对照样品均由指定单位提供。3.7PCR反应3.7.1常规PCR反应操作DB35/T1822—201933.7.1.1PCR反应液配置为：每个反应管的PCR反应体系为25μL，依次加入17.75μL灭菌去离子水，2.5μLTaq聚合酶10×缓冲液，0.5μLdNTPs（2.5mmol/Leach），0.5μLTaqDNA聚合酶（1U/μL），引物CVF0.75μL（10mmol/L），引物DuCVR和GoCVR各0.5μL（10mmol/L），样品DNA2μL，0.5μLMgSO4（50mmol/L）。3.7.1.2PCR反应步骤：混匀后2000r/min离心15s，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行PCR：95℃预热5min后，按以下循环参数循环：94℃、30s，53℃、30s，72℃、1min，循环35次；72℃延伸8min，反应结束后保存于10℃。3.7.2商品化试剂盒PCR反应操作也可采用市售商品化的常规PCR试剂盒，并按试剂盒的操作说明完成。3.8PCR产物电泳反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5μLPCR产物与0.5μL10×加样缓冲液混合均匀，加入到1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中，同时在另一样孔中加5μLDNA作为标准分子量对照；以5V/cm的电场强度进行电泳，30min后经紫外凝胶成像系统观察结果。3.9测序使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现407bp或554bp大小的扩增条带，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，鹅圆环病毒参考序列参见附录B的B.1，鸭圆环病毒参考序列参见附录B的B.2。3.10结果判定3.10.1实验成立条件当阳性对照样品中，鹅圆环病毒样品出现407bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的2号泳道），鸭圆环病毒样品出现554bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的3号泳道），阳性样品混合物出现407bp和554bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的4号泳道），空白对照样品和阴性对照样品均无特异性扩增条带（参见附录C中图C.1的1号、5号泳道），本次实验结果有效。3.10.2待检样品结果判定3.10.2.1当待检样品出现407bp左右特异性条带（参见附录C中图C.1的8号泳道），所获扩增产物与参考序列（参见附录B的B.1）或GenBank数据库中水禽圆环病毒基因序列同源性达到90%以上，可判样品为GoCV核酸阳性；3.10.2.2当待检样品出现554bp左右特异性条带（参见附录C中图C.1的6、7号泳道），所获扩增产物与参考序列（参见附录B的B.2）或GenBank数据库中水禽圆环病毒基因序列同源性达到80%以上，可判样品为DuCV核酸阳性；3.10.2.3无特异性扩增条带（参见附录C中图C.1的9号泳道）判样品为水禽圆环病毒核酸阴性。DB35/T1822—20194AA附录A（规范性附录）相关试剂的配制A.110%十二烷基苯磺酸钠（SDS）称取高纯度的SDS100g置于1000mL烧杯中，加入蒸馏水800mL，68℃加热溶解，温度降至室温后滴加浓盐酸调节pH值至7.2，再定容至1000mL，室温保存备用。A.23mol/L的醋酸钠溶液(NaOAc)称取40.8gNaOAc·3H2O置于200mL烧杯中，加入蒸馏水40mL搅拌溶解，用冰醋酸调剂pH值至5.2，加蒸馏水定容至100mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，常温保存备用。A.375%乙醇取无水乙醇750mL加入蒸馏水250mL，定容至1000mL，-20℃保存备用。A.4溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg蒸馏水至20mLA.51×TAE电泳缓冲液A.5.1配制0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）称取二水乙二铵四乙酸二钠18.61g溶解于适量灭菌去离子水中，混匀后用10%氢氧化钠溶液调pH值为8.0，最后用蒸馏水至100mL。A.5.2配制50×TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL蒸馏水至1000mL用蒸馏水稀释50倍使用。A.5.3配制1×TAE电泳缓冲液50×TAE电泳缓冲液20mL蒸馏水至1000mLDB35/T1822—20195A.61.0%琼脂糖凝胶琼脂糖1.0g1×TAE电泳缓冲液至100mL置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃～60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5µL，摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。A.710×加样缓冲液聚蔗糖25g溴酚蓝0.1g二甲苯青0.1g蒸馏水至100mLA.80.01M磷酸盐缓冲液（PBS）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKH2PO40.2g将上述试剂溶于800mL蒸馏水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，4℃保存备用。说明：上述试剂若有更环保、更安全、操作便捷的正规商品化的试剂可等效使用。BDB35/T1822—20196BC附录B（资料性附录）参考序列B.1PCR扩增的鹅圆环病毒基因序列（共407bp）AATCTCGCGGGAAGTGGTG