DB35T 1872-2019 鸭3型腺病毒病诊断技术

ICS11.220B41DB35福建省地方标准DB35/T1872—2019鸭3型腺病毒病诊断技术Diagnostictechniqueforduckadenovirus3infection2019-12-19发布2020-03-19实施福建省市场监督管理局发布DB35/T1872—2019I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12缩略语............................................................................13疫病概述..........................................................................14临床诊断..........................................................................15PCR诊断...........................................................................16结果判定..........................................................................3附录A（规范性附录）试剂的配制......................................................4附录B（资料性附录）PCR检测结果电泳图..............................................6附录C（资料性附录）参考序列........................................................7DB35/T1872—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业农村厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、傅秋玲、陈珍、朱春华。DB35/T1872—20191鸭3型腺病毒病诊断技术1范围本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定。本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DAdV-3：鸭3型腺病毒（DuckAdenovirus3）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）Tris：三羟甲基氨基甲烷（TrihydroxymethylAminomethane）3疫病概述根据国际病毒分类委员会（TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses）的最新分类：腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄内雏番鸭，临床表现为肝脏肿大、出血，脾脏肿大，胆囊肿大，肾脏肿大、出血。流行病学调查表明，该病发病率20%～50%，病死率60%～70%。4临床诊断4.1剖检病变当鸭出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：a)肝脏肿大，表面呈点状或斑状出血；b)脾脏肿大；c)胆囊肿大；d)肾脏肿大，表面出血。4.2初步诊断当鸭出现4.1中剖检病变之一时，可做出初步诊断；确诊需进行实验室诊断。5PCR诊断5.1主要仪器设备主要仪器设备如下：DB35/T1872—20192a)PCR仪；b)高速台式冷冻离心机；c)微量移液器；d)组织匀浆器；e)电泳仪；f)电泳槽；g)紫外凝胶成像系统。5.2试剂主要试剂如下：a)10%十二烷基硫酸钠（配置方法按照附录A中A.1的规定）；b)蛋白酶K（10mg/mL）（配置方法按照附录A中A.2的规定）；c)异丙醇；d)Tris·饱和酚；e)酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）；f)乙酸钠（3mol/L，pH5.4）；g)无水乙醇；h)75%乙醇（配置方法按照附录A中A.3的规定）；i)核糖核酸酶（20mg/mL）；j)灭菌双蒸水；k)PBS（0.01M）（配置方法按照附录A中A.4的规定）。5.3引物根据DAdV-3的Fiber2基因设计特异性引物，序列如下：上游引物DAdV-3F：5’-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3’。下游引物DAdV-3R：5’-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3’。预期目的片段大小为548bp。5.4核酸DNA提取5.4.1酚氯仿法提取核酸DNA5.4.1.1取2g组织（肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物），加入6mLPBS（0.01M）进行研磨处理，反复冻融3次，4000r/min离心15min，小心吸取上层水相作为组织匀浆液。5.4.1.2取420μL组织匀浆液和30μL核糖核酸酶加入1.5mL灭菌离心管混匀后，室温作用20min。5.4.1.3加入40μL10%的十二烷基磺酸钠溶液和10μL蛋白酶K溶液，56℃水浴2h。5.4.1.4加入等量的Tris·饱和酚，颠倒充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸取上层水相于另一1.5mL灭菌离心管中。5.4.1.5加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸取上层水相于另一1.5mL灭菌离心管中。5.4.1.6加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20℃放置1h。12000r/min离心15min，去上清。加入600μL冰冻预冷的75%乙醇清洗2次，倒置于吸水纸上5min，室温晾干。加入20μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃放置备用。DB35/T1872—201935.4.2试剂盒法提取核酸DNA可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，按照说明书完成核酸DNA提取。5.5对照以纯化的DAdV-3基因组DNA为阳性对照；以灭活的其他鸭源病毒基因组DNA为阴性对照；以灭菌双蒸水为空白对照。5.6PCR扩增5.6.1PCR反应体系为50μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入5μL10×PCR缓冲液，1μL上/下游引物（引物浓度均为20μM）、4μLdNTPMixture（各2.5mM）、2μL提取的基因组DNA、36.5μL灭菌双蒸水、0.5μLTaq聚合酶。2000r/min离心15s。将上述反应混合液按照以下步骤进行PCR扩增，94℃预变性5min；循环参数为94℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸35s，循环35次；第三步72℃再延伸10min结束。5.6.2也可采用市售商品化的等效PCR预混液检测试剂盒，并按照市售商品化的试剂盒推荐的条件进行。5.7PCR产物电泳PCR扩增反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置于2℃～8℃冰箱保存。分别取5μLPCR扩增产物与0.5μL10×加样缓冲液（配置方法按照附录A中A.5的规定）混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶（配置方法按照附录A中A.6的规定）板的加样孔中，加上DNA分子量标准5μL，以5V/cm的电压进行电泳，30min后在紫外凝胶成像系统观察结果。6结果判定6.1实验成立的条件当阳性对照出现约548bp的特异性条带（参见附录B图B.1中1号泳道）、阴性对照无扩增条带（参见附录B图B.1中2号泳道），空白对照无扩增条带（参见附录B图B.1中3号泳道），实验结果成立。6.2实验结果判定当待检样品出现约548bp条带（参见附录B图B.1中4号泳道），可判定为阳性；当待检样品无特异性扩增条带（参见附录B图B.1中5号泳道）判为阴性。必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果和参考序列（参见附录C）进行核苷酸同源性比较，同源性在98.0%以上判为阳性。DB35/T1872—20194AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.110%十二烷基硫酸钠将10g十二烷基硫酸钠溶于80mL灭菌双蒸水中，调节溶液的pH值至7.2，定容至100mL，室温保存备用。A.2蛋白酶K（10mg/mL）将蛋白酶K（20mg/mL）和灭菌水按照体积比1:1配置，使用前现用现配。A.375%乙醇取无水乙醇750mL加入灭菌双蒸水250mL，定容至1000mL，-20℃保存备用。A.4PBS（0.01M）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKH2PO40.2g将上述试剂溶于800mL灭菌双蒸水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，4℃保存备用。A.510×加样缓冲液聚蔗糖25g溴酚蓝0.1g二甲苯青0.1g灭菌双蒸水定容至100mLA.61.0%琼脂糖凝胶琼脂糖1.0g1×TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.7的规定）定容至100mL置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃～60℃时，加溴化乙锭溶液（配制方法按照A.8的规定）5μL，摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。DB35/T1872—20195A.71×TAE电泳缓冲液50×TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.9的规定）20mL灭菌双蒸水定容至1000mL。A.8溴化乙锭溶液溴化乙锭20mg灭菌双蒸水定容至20mL说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染料。A.950×TAE电泳缓冲液Tris242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL灭菌双蒸水定容至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。DB35/T1872—20196BB附录B（资料性附录）PCR检测结果电泳图PCR检测结果电泳图如图B.1所示。说明：M——DNA分子量标准；1——阳性对照（鸭3型腺病毒）；2——阴性对照（灭活的其他鸭源病毒）；3——空白对照；4——待检样品（鸭3型腺病毒阳性）；5——待检样品（阴性）。图B.1PCR检测结果电泳图M12345bp20001000750500250100bp548DB35/T1872—20197CC附录C（资料性附录）参考序列鸭3型腺病毒参考序列：ACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCATACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCGTGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGCGCTGAGGATGCATCACATGCTGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCCACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAATGTTTCAGAACATGACTTTATTCTGTATAACTATAGTGG