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DB××ICS:65.120B20山东省地方标准DB37/T666—2007饲料中地西泮的测定液相色谱质谱联用法DeterminationofdiazepaminfeedsbyLC-MS2007-03-09发布2007-05-01实施DB37山东省质量技术监督局发布DB37/T666—2007I前言本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由山东省畜牧办公室提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省饲料监察所。本标准主要起草人：汤文利、梁萌、任爱丽、陈淑沂。DB37/T666—20071饲料中地西泮的测定液相色谱质谱联用法1范围本标准规定了用高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)测定饲料中地西泮的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中地西泮的测定。本标准高效液相色谱最低定量限为1mg/kg，质谱最低确证限为1mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3原理试样用液液萃取，经固相萃取柱净化，用反相液相色谱柱分离后，紫外检测器检测，外标法定量。并采用质谱检测器以地西泮的质量色谱峰保留时间和特征离子确证。4试剂除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水符合GB/T6682一级水的规定。4.1甲醇，色谱醇。4.2乙腈，色谱醇4.3乙酸。4.4碳酸钠溶液：ρ（Na2CO3）=100g/L。4.5提取液：正己烷＋二氯甲烷＝7＋3。4.6乙酸铵溶液：c(CH3COONH4)=25mmol/L。准确称取1.927g乙酸铵，用水溶解、加入2mL乙酸（4.3），用水定容至1000mL,过0.45μm的微孔滤膜。4.7流动相：乙腈（4.2）＋乙酸铵溶液（4.6）＝45＋55。用前超声脱气5min。4.8地西泮标准溶液。4.8.1地西泮标准贮备液(100μg/mL）称取0.010地西泮标准品，精确至0.1mg（含量≥99.0%），用甲醇(4.1)溶解、定容至100mL。4.8.2地西泮标准工作液准确移取地西泮标准贮备液（4.8.1），用甲醇（4.1）定容，配制成1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL的标准工作液。5仪器5.1实验室用样品粉碎机。5.2分析天平：感量0.1mg。5.3离心机：4000r/min。5.4超纯水器。DB37/T666—200725.5超声波清洗器。5.6旋涡混合器。5.7具盖塑料离心管：100mL。5.8硅酸镁固相萃取小柱：200mg3mL。5.9高效液相色谱仪，具紫外检测器。5.10离子阱质谱仪。6试样的制备按GB/T20195规定执行。7分析步骤7.1提取称取试料约2g（精确至0.1mg）于离心管（5.7）中，加水20mL，用碳酸钠溶液（4.4）调pH至8~9。准确加入提取液（4.5）15.00mL，轻摇数秒，加盖密封，旋涡（5.6）混匀数秒，放气；旋涡混匀30秒两次；离心机（5.3）4000r/min离心5分钟；吸取上清液于具塞试管中。再准确加入提取液（4.5）15.00mL，重复上述操作，合并两次上清液，旋涡混匀。7.2净化准确移取上述试液适量（配合饲料取15.00mL、浓缩饲料取6.00mL、添加剂预混合饲料取3.00mL），注入已用甲醇（4.1）2mL和提取液（4.5）3mL处理过的硅酸镁固相萃取小柱（5.8），液体的过柱速度为成滴滴下。用水3mL淋洗，再用2.00mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液。调整甲醇（4.1）用量，使洗脱液中地西泮的浓度在1.00μg/mL-50.0μg/mL之间。旋涡混匀，过0.2μm微孔滤膜，待测。7.3测定7.3.1色谱参考条件色谱柱：C18柱，250mm×4.0mm，id，5μm，或性能类似的分析柱。柱温：室温。检测器：紫外检测器，检测波长254nm。流动相：乙腈+乙酸铵溶液=45+55。流速：1mL/min。进样量：20μL。7.3.2定量用紫外检测器测定标准工作液（4.8.2）和洗脱液（7.2）中地西泮峰面积的响应值，用多点校准法定量。7.4确证7.4.1质谱参考条件色谱柱：C18柱，250mm×4.0mm，id，5μm，或性能类似的分析柱。柱温：室温。流动相：乙腈+乙酸铵溶液=45+55。流速：0.2mL/min。进样量：20μL。离子化模式：正离子化，电喷雾电离源（ESI+）。地西泮选择离子：m/z285，257，222，154。雾化气压力：40.0psi。干燥气流速：9.0L/min。DB37/T666—20073干燥气温度：350℃。毛细管出口电压：-3500V。离子电荷控制（ICC）:on。7.4.2确证通过样品总离子流色谱图上地西泮的保留时间及其色谱峰对应的特征离子（m/z285、m/z257、m/z222、m/z154）,与标准品相应的保留时间及其色谱峰对应的特征离子进行对照定性。样品相对峰度比与标准品相对峰度比相差不大于30%。8结果计算试样中地西泮的含量以质量分数X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算；A×V1×V2X=——————………………………(1)m×V3式中：A—地西泮色谱峰的峰面积对应的含量的数值，单位为微克每毫升（μg/mL）；V1—加入提取液的体积的数值，单位为毫升（mL）；V2—甲醇洗脱液的体积的数值，单位为毫升（mL）；m—试料质量的数值，单位为克（g）；V3—移取提取液上硅酸镁固相萃取小柱的体积的数值，单位为毫升（mL）。计算结果表示到三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的10％，以大于这两个测定值的算术平均值的10%情况不超过5％为前提。DB37/T666—20074附录A（资料性附录）地西泮特征离子表A.1给出了地西泮确证方法的特征离子表A.1地西泮确证方法的特征离子特征离子（m/z）285257222154结构式[M+H]+([M+H]-CO)+([M+H]-CO-Cl)+([M+H]-C2H3NO-C6H2)+DB37/T666—20075附录B（资料性附录）地西泮二级质谱图图B.1给出了地西泮的二级质谱图图B.1地西泮二级质谱图105.1118.1141.0154.0166.9182.0193.0204.0222.1228.0257.1285.1+MS2(285.1),12.8-13.3min(#2381-#2436)0245x10Intens.100150200250300350m/z