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ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T2031—2012奶牛DNA亲子鉴定技术规程TechnicalSpecificationforDNAParentageIdentificationinDairyCattle2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2031—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。本标准主要起草人：黄金明、张思聪、鞠志花、李建斌、李荣岭、李秋玲、侯明海、曲绪仙、仲跻峰。DB37/T2031—20121奶牛DNA亲子鉴定技术规程1范围本标准规定了奶牛DNA亲子鉴定的技术方法。本标准适用于奶牛DNA亲子鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1917-2007牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1亲子鉴定（parentageidentification）利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。3.2亲权指数(paternityindex,PI)假设亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性和随机亲代亲提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性的比值。3.3LOD值亲权指数的对数值。3.4亲权（父、母）相对机会（Relativechancepaternity，RCP）表示疑似亲代是真实亲代的机会。RCP的计算：DB37/T2031—201221+=PIPIRCP..........................(1)式中：PI—亲权指数。多个标记累计的PCP计算：RCPI）（RCP−∏−−=111累计.............................(2)式中：RCPi—第i标记的RCP。3.5微卫星（DNAmicrosatellite）也称短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR)。是一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心序列为2～6bp,重复次数通常为15～30次的DNA串联重复序列。3.6多重聚合酶链反应（multiplexPCR）又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。4鉴定原理利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除亲子关系。5主要试剂配制除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水；高压灭菌条件为1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。6主要仪器设备见附录B。7检测方法7.1样本采集静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。对公牛，亦可采集2～3剂细管精液，液氮保存。7.2DNA提取DB37/T2031—201237.2.1血液DNA的提取用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T1917-2007的规定执行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。7.2.2精液DNA提取从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500µL生理盐水，混匀，12000rpm离心1min，弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400µL及5µL蛋白酶K，旋涡混合器悬浮；56℃消化10～12h，至溶液澄清透明；加入300µL苯酚，轻轻混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150µL酚和150µL氯仿，轻轻混合5min；吸取上清液，加入500µL无水乙醇（4℃保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑出，1mL的70%乙醇洗涤，凉干，加入400µL双蒸水，充分溶解，4℃或-20℃保存。7.3DNA浓度和纯度检测按照NY/T1672-2008的规定执行。7.4引物序列引物序列参考联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)的推荐引物。12个微卫星标记分为4个扩增组合，具体见附录C。7.5PCR扩增7.5.1多重PCR扩增体系产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25µL反应体系：10×Buffer2.5µL、50mmol/LMgCl21.2µL、10mmol/LdNTP0.6µL、TaqDNA聚合酶2U、10µmol/L引物(扩增组合)各1.0µL、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100ng、加双蒸水至反应总体积为25µL。PCR扩增时设计阴性对照（双蒸水作为模板）。7.5.2PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性30s，57～60.5℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。7.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测7.6.1先用水清洗制胶板，再用1×TAE冲洗一次，水平放置。7.6.2根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制1%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄清透明，室温下冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭并混匀，使EB的终浓度为0.5μg/mL。7.6.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。7.6.4将待检PCR产物5µL和上样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）以5:1的比例混合均匀，加入点样孔；同时选择点样孔点上5µL2000bpDNAMarker作参照。恒压100V，电泳30min。电泳结束后于凝胶成像系统观察,并分析记录。7.7微卫星DNA多态性分析DB37/T2031—20124PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按0.5µL:lOµL:O.5µL比例混合，95℃变性5min，ABIPRISM3100仪器测序，ABIPRISM3100DATACOLLECTION软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TAMRA分别表示蓝色、绿色和黑色。8结果判定8.1多重PCR产物检测若4个PCR管均出现清晰条带，表明产物扩增成功，可以进行测序。图1多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图注：1-TGLA53、INRA023位点两重PCR产物；2-TGLA227、TGLA122、BM1818位点三重PCR产物；3-BM2113、ETH225、ILSTS006位点三重PCR产物；CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115位点四重PCR产物；M:DL500DNAMarker。8.2微卫星标记分型利用ABI3100仪器对微卫星标记进行基因分型。检测个体的12个微卫星标记的基因分型结果如附录D所示，根据相对荧光强度和片段大小，可获得待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体，其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型。阳性对照样品12个STR标记不同等位基因的大小如附录E所示。8.3亲子关系判定根据待检个体STR标记的基因型，利用Cervux3.0软件分别计算其亲子指数的LOD值。当LOD＞0时，候选亲本有可能是真实的亲代，LOD值最高的个体是最相似的亲本个体，其RCP值即表示该亲本是真实亲本的机会；当LOD0时，候选亲本不可能是真实的亲本。9废弃物的处理按照NY/T1672的规定执行。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193的规定执行。DB37/T2031—20125AA附录A（资料性附录）主要试剂配制A.1ACD抗凝剂柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，定容于100mL水中，高压灭菌。A.210%SDS(十二烷基硫酸钠)100gSDS溶于90mL水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的滤膜过滤，高压灭菌。A.3PBS（磷酸缓冲液）8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH值到7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。A.40.5mol/LNaCl（氯化钠）5.844gNaCl溶于双蒸水中，加水定容至200mL，高压灭菌。A.5蛋白酶K(20mg/mL)200mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分装，-20℃冷冻保存。A.6氯仿异戊醇（24:1）：异戊醇21mL加入到500mL的氯仿试剂瓶中，混匀。A.71mol/LTris.HCl(pH=8.0)将121.1gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。A.80.5mol/LEDTA(pH8.0)800mL水中加入186.1gEDTA-Na2•2H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0，然后定容至1L，高压灭菌。A.9TE缓冲液DB37/T2031—20126取1mol/LTris.HCl（pH8.0）10mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）2mL，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。A.10血样裂解液1mol/LTris.HCl(pH=8.0)1mL，0.5mol/LEDTA(pH=8.0)20mL，10%SDS5mL，双蒸水74mL。A.11精子DNA抽提液称取二硫苏糖醇0.06g与1mL0.5mol/LTris.Cl，0.5mol/LEDTA，5mol/LNaCl，2ml10%SDS混合后，补水至10mL。A.1210mg/mL溴化乙锭在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB），溶解后分装成1mL小份，4℃保存。A.1350×TAE缓冲液Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL，加水定容至1000mL。A.14２%的琼脂糖2g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。A.15琼脂糖电泳上样缓冲液0.25%溴酚兰；0.25%二甲苯菁FF；40%的蔗糖水溶液。DB37/T2031—20127BB附录B（资料性附录）主要仪器设备B.1单道可调移液器2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL。B.2基因扩增仪温度范围4℃-99℃,温度梯度范围20℃,模块单元96×0.2mL。B.3离心机最高转速12000r/min，最大容量24×1.5mL。B.4恒温振荡器0r/min-200r/min，0℃-60℃。B.5电子天平量程0.001g-100g，感量0.001g。B.6旋涡混合器转速2800r/min，工作台直径￠110mm。B.7手持式均质器转速范围5000-35000rpm，处理量0.05-100mL。B.8紫外分光光度计波长范围200-1000nm。B.9凝胶成像分析系统有效像素1280×1024，检测灵敏度DNA≥0.05ng。B.10稳压稳流电泳仪DB37/T2031—20128输出电压0-600V，输出电流0-100mA。B.11水平电泳槽外形尺寸182mm×85mm×5mm，凝胶板面积60mm×60mm。B.12高压灭菌锅使用温度范围45-135℃，最高使用压力0.255Mpa。B.13自动双重纯水蒸馏器功率3000W，出水量2500mL\h。B.14微波炉容积20L，尺寸262mm×452mm×365mm。B.15干燥箱温控范围50-300℃，箱内尺寸350mm×350mm×450mm。B.16冰箱4℃