DB37T 2038-2012 牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程

ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T2038—2012牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程Technicalspecificationofdetectionfordeficiencyofuridinemonophophatesynthaseinbovine2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2038—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。本标准主要起草人：李荣岭、张思聪、王洪梅、李秋玲、李建斌、黄金明、鞠志花、王长法、侯明海、曲绪仙、仲跻峰。DB37/T2038—20121牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程1范围本标准规定了牛DUMPS分子检测的技术方法。本标准适用于牛DUMPS分子检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1尿苷酸合酶缺乏症deficiencyofuridinemonophophatesynthase尿甘酸合酶缺乏症是由于牛体内尿苷酸合酶（UridineMonophophateSynthase，UMPS）基因的C-末端405处的密码子存在一个点突变，使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子UGA引起。3.2限制性内切酶restrictionendonuclease限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。3.3限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)限制性片段长度多态性是根据基因组上限制性内切酶切位点核苷酸发生突变，或酶切位点之间发生核苷酸的插入、缺失而导致酶切片段长度发生变化，对基因突变进行检测的一种方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DB37/T2038—20122dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）bp：碱基对（basepair）5检测原理尿甘酸合酶缺乏症是由于奶牛体内尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405处的密码子存在一个点突变（碱基1→碱基2），使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的UGA，导致含有纯合突变基因型的胚胎早期死亡。基于这个点突变设计引物对该区域进行PCR扩增以及RFLP分析，由于野生型与突变型个体的基因片段的长度存在显著差异，因而，通过PCR-RFLP分析会在聚丙烯酰胺凝胶上产生不同的带型，可根据奶牛个体在凝胶中呈现带型的不同来判断被检测个体的基因型。6主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的双蒸水；高压灭菌条件为1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂及配制方法见附录A。7主要仪器设备主要仪器设备见附录B。8检测方法8.1样本采集静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，-20℃保存。公牛可用2～3剂细管精液，-196℃保存。8.2基因组DNA提取8.2.1血样中DNA的提取提取方法见附录C。8.2.2精液中DNA的提取提取方法见附录D。8.3基因组DNA检测具体按照NY/T1672-2008的规定执行。8.4引物的设计与合成上游引物：5'-GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT-3'；下游引物：5'-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3'。扩增产物大小为95bp。8.5PCR扩增8.5.1PCR扩增体系DB37/T2038—20123PCR扩增反应总体积为20μL，其中10×PCRBuffer(含15mmol/L的Mg2+)2.0μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板100ng，加双蒸水至20μL。8.5.2PCR扩增循环参数PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。8.5.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶制备需要胶板、隔板、微波炉、三角瓶和多齿梳子、一次性手套等。先用水清洗制胶板，再用1×TAE冲洗一次，水平放置。称取1g的琼脂糖，溶解于100mL1×TAE中，在微波炉中加热融化至溶液澄清透明，室温下冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭并混匀，使其终浓度为0.5μg/mL，即得1％的琼脂糖溶液。将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子后将凝胶转移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。将待检PCR产物5µL和上样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）以5:1的比例混合均匀，加入点样孔，同时选择点样孔点上5µL2000bpDNAMarker作参照。恒压100V，电泳20min。电泳结束后于凝胶成像系统观察,并分析记录。8.6RFLP分析8.6.1RFLP酶切体系10μL酶切体系：PCR产物1.0μL，限制性内切酶AVaI（10U/μL）0.3μL，10×Buffer1μL，超纯水8.7μL，37℃水浴消化过夜。8.6.2RFLP产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电泳，2h后硝酸银染色照相，记录基因分型。聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的操作步骤见附录E。9结果判定9.1PCR扩增产物检测扩增产物大小为95bp，条带清晰（见图1），可进行下一步检测。图1UMPS基因PCR扩增结果（DL2000DNAMaker）DB37/T2038—201249.2PCR-RFLP结果UMPS基因经酶切后，根据RFLP图谱分为2种基因型：正常基因纯合子（-/-），携带突变基因的杂合子（-/+），如图2（另有21bp酶切片段由于片段较小，电泳中没有显示）。图2酶切产物SDS-PAGE电泳结果（50bpDNALander）10废弃物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施按照NY/T1672-2008和SN/T1193执行。DB37/T2038—20125AA附录A（资料性附录）主要仪器设备A.1凝胶成像分析系统A.2单道可调移液器：2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μLA.3基因扩增仪A.4离心机A.5恒温振荡器：0r/min～200r/min，0℃～60℃A.6电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001gA.7旋涡混合器A.8手持式均质器A.9紫外分光光度计A.10凝胶成像分析系统A.11稳压稳流电泳仪A.12水平电泳槽A.13高压灭菌锅A.14自动双重纯水蒸馏器A.15微波炉A.16干燥箱A.17-20℃冰箱A.18恒温水浴锅DB37/T2038—20126BB附录B（资料性附录）试剂及配制方法B.1ACD抗凝剂柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，用双蒸水定容至1000mL，高压灭菌。B.210﹪SDS(10﹪十二烷基磺酸钠)称取SDS2g，加超纯水18mL，加热至68℃助溶，加HCl调pH至7.2。B.3蛋白酶K(20mg/mL)200mg蛋白酶K溶于10mL水中，以1mL分装，-20℃保存。B.4TE溶液即1×TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0)。取1mmol/LTris-HCl10mL，0.5mmol/LEDTA0.2mL，用双蒸水定容至100mL，高压灭菌。B.51mol/LTris-HCl缓冲液在800mL水中溶解121.1gTris碱，加HCl调pH值至8.0，用双蒸水定容至1000mL，分装后高压灭菌。B.60.5mol/LEDTA(pH8.0)称取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O)18.61g，NaOH2g，加水至80mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，完全溶解后定容至100mL，高压灭菌。B.7血液DNA提取液10mmol/LTris·Cl（pH8.0）、0.1mol/LEDTA(pH8.0)、0.5﹪SDS。B.8冷冻精液DNA提取液10mmol/LTris·Cl（pH7.4）、10mmol/LNaCl、0.1mol/LEDTA(pH8.0)、1%SDS、2﹪β-巯基乙醇。B.93mol/LNaAc（pH5.2）在80mL双蒸水中加入40.81g醋酸钠，用醋酸调节pH值至5.2，加水定容至100mL。DB37/T2038—20127B.104mol/LNaOH80gNaOH溶于400mL水中，定容至500mL，高压灭菌；B.1150×TAE750mL双蒸水中溶解242gTris碱，加入57.1mL乙酸，100mL的0.5mol/L的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000mL。B.12溴化乙锭EB（10mg/mL）10mL双蒸水加入0.1gEB，完全溶解后避光保存，4℃保存。B.13琼脂糖电泳上样品缓冲液0.25﹪溴酚蓝，0.25﹪二甲苯青FF，40﹪（w/v）蔗糖溶液。B.1410×TBETrisBase54g、硼酸27.5g、EDTA(0.5M)pH8.020ml，加超纯水至1L。B.151﹪琼脂糖凝胶溶液取琼脂糖1g、10×TBE20mL、EB5μL，加超纯水定容至100mL。B.1610﹪过硫酸铵1g过硫酸铵溶解于10mL水中，4℃保存。B.1730﹪丙烯酰胺（49：1）丙烯酰胺147g和N，N′-亚甲双丙烯酰胺3g溶解于400mL水中，将溶液加热至37℃溶解，完全溶解后定容至500mL，置棕色瓶中4℃保存。B.18变性剂95﹪甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.05﹪溴酚蓝。B.190.1﹪AgNO3溶液1gAgNO3用水溶解后，定容至1L。B.202﹪碳酸氢钠显色液DB37/T2038—20128称取10gNaHCO3，溶解于400ml蒸馏水中，加2mL甲醛，加水至0.5L，充分溶解混匀，现用现配。B.21氯仿:异戊醇（24:1）异戊醇21mL加入到500mL氯仿中，混匀。B.22酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）酚、氯仿和异戊醇按照体积比25:24:1混合，保存于4℃棕色瓶中，并处于0.1mol/LTris·cl(PH8.0)覆盖之下。DB37/T2038—20129CC附录C（资料性附录）血液中DNA的提取方法C.1取1mL全血融化，加入等体积PBS缓冲液。C.2混匀10min，12000rpm离心5min，弃上清，重复3次。加入500μL抽提缓冲液，悬浮沉淀，加入RNaseA终浓度20μg/mL，37℃水浴1h。C.3加入蛋白酶K，其终浓度为100μg/mL，56℃水浴温和振荡，消化完全，至不见粘稠团块。C.4加入等体积Tris饱和酚、温和颠倒混合至少5min，12000rpm、4℃离心8min；取上清，同上，重复抽提。C.5取上清，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液，同上，重复抽提；取上清，加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），同上，重复抽提。C.6取上层水相，加入等体积的异丙醇（-20℃），沉淀DNA，水平轻摇即可看到絮状DNA沉淀，12000rpm、4℃离心2min。C.7加入1mL75﹪的冰乙醇（-20℃）洗涤DNA沉淀2次，12000rpm、4℃离心3min。C.8小心倒掉乙醇，用吸水纸残留的乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于3