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ICS67.120.30B50DB37山东省地方标准DB37/T2094—2012水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法DeterminationofHydroxyprolineinFisheryProductsbyHighPerformanceLiquidChromatography2012-03-21发布2012-05-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2094—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。本标准主要起草人：刘慧慧，张秀珍，徐英江，田秀慧，于召强，邓旭修。DB37/T2094—20121水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了水产品中羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法。本标准适用于水产品中羟脯氨酸含量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理用盐酸于110℃水解试样，稀释、过滤水解产物，羟脯氨酸经DABS-Cl衍生后，用C18柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，外标法定量。4试剂4.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯。4.2试剂主要包括：——实验用水：应符合GB/T6682中一级水标准；——乙腈：色谱纯；——盐酸；——无水乙醇；——N，N-二甲基甲酰胺；——碳酸氢钠；——氢氧化钠；——柠檬酸：优级纯；——磷酸二氢钠；——二甲基氨基偶氮苯磺酰氯：DABS-Cl（4-Dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonylchloride），纯度≥98﹪；——羟脯氨酸标准品：L-羟脯氨酸（L-Hyp），纯度≥99﹪；——羟脯氨酸标准储备溶液：准确称取羟脯氨酸标准品0.1000g，用水溶解并定容至100mL。此溶液浓度为1.00g/L。4℃避光保存，有效期1个月；——羟脯氨酸标准中间溶液：移取羟脯氨酸标准储备溶液，用水逐级稀释至1.0mg/L。临用时配制；——0.1mol/L碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠8.4g，用水溶解并稀释至1L；——2mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠80g，用水溶解并稀释至1L；DB37/T2094—20122——0.1mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.0g，用900mL水溶解，加2mol/L氢氧化钠溶液70mL，用2mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH6.4，用水定容至1L；——12mmol/L柠檬酸溶液：量取0.1mol/L柠檬酸溶液120mL，加N，N-二甲基甲酰胺40mL，用水稀释至1L；——衍生试剂溶液：称取DABS-Cl0.013g，用乙腈溶解并定容至10mL，4℃避光保存，有效期1个月；——衍生反应终止液：配制50mmol/L磷酸二氢钠溶液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH7.0，再加等体积无水乙醇；——6mol/L盐酸溶液：取盐酸50mL，加水稀释并定容至100mL。5仪器与设备主要包括：——高效液相色谱仪：配紫外检测器；——天平：感量0.01g；——电子天平：感量0.0001g；——匀浆机；——电热恒温干燥箱；——恒温水浴；——真空泵；——酒精喷灯；——微孔滤膜：0.45µm；——涡旋混合器。6试样制备鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，将肌肉、鳞、皮单独收集；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；蟹、贝、甲鱼、海参、海带等取可食部分，样品充分搅碎、混匀。如不能及时检测，-18℃以下冷冻保存备用。7测定步骤7.1水解称取适量匀浆后的样品于水解管中，使每管中含蛋白质约20mg，加入6mol/L盐酸6mL，充氮气1min，抽真空至管内盐酸起泡，用火焰将管封口。于110℃水解22h，冷却后，将水解液全部转移到50mL容量瓶中，加水至刻度。混匀后，根据样品中羟脯氨酸含量不同，分别取1mL～5mL水解液于10mL容量瓶中，加2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.5，加水稀释至刻度。取1mL稀释液用0.45μm滤膜过滤备用。7.2衍生取过滤后的稀释液30μL于1.5mL具塞离心管中，加0.1mol/L碳酸氢钠溶液30μL，衍生试剂溶液60μL，漩涡混匀30s，70℃水浴中衍生反应，2min时取出漩涡混匀1次，继续于70℃水浴中反应13min，反应结束后取出迅速冷却，加入衍生反应终止液630μL，用0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱分析。DB37/T2094—201237.3测定7.3.1色谱条件主要包括以下几项：a)色谱柱：MG-C18柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5μm，或与之性能相当者；b)流动相：A：12mmol/L柠檬酸溶液（4.17）；B：30%A＋70%乙腈（含4%N，N-二甲基甲酰胺）；梯度洗脱程序见表1；c)流速：1.4mL/min；d)柱温：35℃；e)进样量：20μL；f)检测波长：436nm。表1梯度洗脱程序时间/min流动相A/﹪流动相B/﹪0752517.2445620.6148623.2148624.2010029.2010029.575254075257.3.2标准曲线移取适量标准中间溶液，用水稀释至以下浓度：1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL，分别取30μL于1.5mL具塞离心管中，按6.3方法衍生，相当于羟脯氨酸浓度40μg/L、80μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L、2000μg/L。以Hyp质量浓度为横坐标，对应的峰高为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。7.3.3色谱分析在上述色谱条件下，分别取20μL衍生后的标准工作溶液及样品溶液进样测定，标准工作溶液和样品溶液中羟脯氨酸的响应值均应在仪器检测线性范围内。标准品保留时间参考值为：羟脯氨酸13.6min(见附录A)。8空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。9结果计算样品中羟脯氨酸含量按公式（1）计算。计算结果需扣除空白值。结果保留三位有效数字。DB37/T2094—20124KmVX××××=501000ρ..................................(1)式中：X——样品中羟脯氨酸含量，单位为毫克每克（mg/g）；ρ——样品溶液中羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；M——样品的称取量，单位为克（g）；K——稀释倍数；50——样品稀释液体积。10灵敏度本方法的检出限4.0mg/g。11准确度本标准添加浓度为4.0mg/g～100mg/g时，加标回收率为70﹪～110﹪。12精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15﹪。DB37/T2094—20125AA附录A（资料性附录）色谱图13.233HYP-13.552AU-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035分钟10.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.00图A.1羟脯氨酸标准溶液（10μg/mL）色谱图13.231AU-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035分钟10.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.00图A.2空白色谱图HYP-13.669AU-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035分钟10.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.00图A.3海参样品色谱图_________________________________