DB37T 2140-2012 预混合饲料中维生素B1、B2、B6和烟酰胺的同步测定 高效液相色谱法

ICS65.120B46DB37山东省地方标准DB37/T2140—2012预混合饲料中维生素B1、B2、B6和烟酰胺的同步测定高效液相色谱法DeterminationofvitaminB1、B2、B6andniacinamideinfeedHighperformanceliquidchromatography2012-05-14发布2012-07-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2140—2012I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：山东省饲料质量检验所。本标准主要起草人：强莉、李桂华、刘雪芹、李俊玲、战余铭、张玮、王现杰。DB37/T2140—20121预混合饲料中维生素B1、B2、B6和烟酰胺的同步测定高效液相色谱法1范围本标准规定了用高效液相色谱仪同步测定预混合饲料中维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的方法。本标准适用于维生素预混合饲料和复合预混合饲料中维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的测定。本方法最低定量限维生素B1、维生素B6、烟酰胺为40mg/kg，维生素B2为10mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3原理试料中的维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺用盐酸溶液提取、过膜后，在高效液相色谱反相柱上分离，紫外检测器280nm处测定，外标法定量。4试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水符合GB/T6682一级水的规定。试剂包括：a)乙腈：色谱纯；b)三氟乙酸：色谱纯；c)冰乙酸：优级纯；d)盐酸；e)氢氧化钠；f)盐酸溶液：c(HCl)=0.5mol/L。量取45mL的盐酸注入1000mL的水中；g)盐酸溶液：c(HCl)=0.1mol/L。量取9mL的盐酸注入1000mL的水中；h)氢氧化钠溶液：c(NaOH)=2mol/L。称取8g氢氧化钠,溶于100mL水中；i)0.1﹪三氟乙酸溶液：准确吸取三氟乙酸1.00mL于1000mL容量瓶，用水定容，摇匀；j)流动相：乙腈和0.1﹪三氟乙酸溶液；k)维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺标准品：纯度大于98﹪；l)标准贮备溶液，操作步骤如下：DB37/T2140—201221)维生素B1标准贮备溶液：准确称取维生素B1标准品0.0200g于100mL棕色容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解，超声15min，待全部溶解后，用0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度，此溶液浓度为200µg/mL。避光操作。置2℃～8℃冰箱保存，保质期3个月；2)维生素B2标准贮备溶液：准确称取维生素B2标准品0.0200g于100mL棕色容量瓶中，加5mL2mol/L氢氧化钠溶液溶解，超声使其全部溶解后，加约60mL水，再加2.5mL冰乙酸，用水定容至刻度，此溶液浓度为200µg/mL,置2℃～8℃冰箱保存，保质期3个月；3)维生素B6标准贮备溶液：准确称取维生素B6标准品0.0200g于100mL棕色容量瓶中，加水溶解，超声15min，待全部溶解后，用水定容至刻度，此溶液浓度为200µg/mL,置2℃～8℃冰箱保存，保质期3个月；4)烟酰胺标准贮备溶液：准确称取烟酰胺标准品0.0200g于100mL棕色容量瓶，用水溶解、定容至刻度,此溶液浓度为200µg/mL,置2℃～8℃冰箱保存，保质期3个月。m)混合标准工作溶液，操作步骤如下：1)分别准确移取维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的标准贮备溶液10.00mL于同一100mL棕色容量瓶中，用0.1﹪三氟乙酸溶液定容。该溶液浓度为20µg/mL，现用现配；2)准确移取上述混合标准溶液2.5mL、5mL、10mL、25mL、50mL于100mL棕色容量瓶中，用0.1﹪三氟乙酸溶液稀释至100mL。该标准系列中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺的相应浓度分别为:0.50µg/mL、1.00µg/mL、2.00µg/mL、5.00µg/mL、10.00µg/mL，现用现配。5仪器和设备仪器和设备主要包括：a)高效液相色谱仪：配有紫外检测器；b)分析天平：感量0.1mg；c)超声波清洗器：可加热至80℃；d)离心机：转速大于4000r/min；e)针头过滤器：备0.45µm（或0.2µm）滤膜。6试样的制备选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195制备样品，全部通过孔径为0.45mm的试验筛，混匀。装入密闭容器中保存。7分析步骤7.1提取准确称取试料适量(维生素预混合饲料0.25g～0.5g，复合预混合饲料1g～5g)，精确至0.0002g，置于100mL容量瓶中，加入盐酸溶液50mL，80℃水浴超声提取30min，中间振摇2～3次。用水定容，摇匀，于离心机上4000r/min离心5min。取上清液适量过滤膜，待测。对于维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺含量较高的饲料，可先取适量上清液，用水稀释，使试样溶液中维生素最终浓度为0.5µg/mL～20µg/mL。DB37/T2140—201237.2液相色谱参考条件液相色谱参考条件主要包括：a)色谱柱：C18,150mm×4.6mm，粒径5μm；b)柱温:30℃；c)流动相:梯度洗脱见表1；d)流速:1.30mL/min；e)检测器:紫外检测器；f)检测波长:280nm；g)进样量:10µL。表1流动相梯度表时间（min）乙腈（﹪）0.1%三氟乙酸溶液（﹪）0.000.0100.00.700.0100.05.003.097.06.0015.085.011.0020.080.011.5090.010.015.5090.010.016.000.0100.020.000.0100.07.3测定7.3.1标准曲线的绘制将混合标准工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪，以维生素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的工作曲线，并计算回归方程。7.3.2试样测定将待测液注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，以峰面积定量。8结果计算试样中维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的含量以质量分数Xi计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式(1)计算，测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字：nmVcXii.....................................(1)式中：ci--标准曲线上查得的某种维生素浓度的数值，单位为微克每毫升（µg/mL）；V--试样提取时定容体积，单位为毫升（mL）；m--试料的质量，单位为克（g）；DB37/T2140—20124n--稀释倍数。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的10﹪，以大于这两个测定值的算术平均值的10﹪情况不超过5﹪为前提。DB37/T2140—20125AA附录A（资料性附录）标准样品参考图谱烟酰胺-2.462维生素B1-3.814维生素B6-5.972维生素B2-10.613AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035分钟0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.00图A.1维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺混合样品图谱_________________________________