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ICS65.020.30B41DB41河南省地方标准DB41/T1515—2017猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法2017-12-06发布2018-03-06河南省质量技术监督局发布DB41/T1515—2017I前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，郑州市畜牧技术推广站，焦作市动物疫病预防控制中心,驻马店市动物疫病预防控制中心、开封市动物卫生监督所、郑州市中心医院。本标准主要起草人：崔沛、班付国、闫若潜、曹伟伟、马震原、陈悦、王淑娟。本标准参加起草人：王英华、谢彩华、王翠、王华俊、赵胜杰、赵明军、王东方、郭育培、张敏、杨晴、张煜、刘先敏、靳冬、刘淑敏。DB41/T1515—20171猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法1范围规定了猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测的试剂和仪器设备,样品采集、处理、存及运输,操作方法、结果判定。适用于对疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、血液，精液，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等样品中病毒核酸的检测。2试剂和仪器设备2.1试剂2.1.1除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂应使用无RNA酶污染的容器进行分装。2.1.2组织悬液（见附录A），-20℃保存。2.1.3裂解液（TriZol），氯仿，1×核酸电泳缓冲液，0.01mol/L（pH7.2）的PBS（见附录A），DEPC处理水（见附录A），以上试剂4℃保存。2.1.4组织样品悬液常规试剂（见附录A）常温保存。2.1.5裂解液（TriZol），氯仿，0.01mol/L（pH7.2）PBS（见附录A），DEPC水（二乙基焦碳酸酯处理的水），均应2℃-8℃保存。2.1.6异丙醇，75%乙醇，应-20℃保存。2.1.7阳性对照样品、阴性对照样品见附录A。2.1.8RT-PCR扩增用上、下游引物序列见附录B。2.1.9猪乙型脑炎病毒RT-PCR试验反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。2.2仪器设备PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心转速在12000r•min-1以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，生物安全柜，组织匀浆器，2℃～8℃冰箱，-70℃冰箱，单道微量移液器（0.1µL～2.5µL；0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000µL）凝胶成像系统(或紫外透射仪)，真空干燥器。3样品的采集、处理、存放及运输3.1样品的采集DB41/T1515—201723.1.1采取疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎及公猪精液等靶组织样品，装入灭菌1.5mL离心管中，编号，送实验室。3.2样品的处理3.2.1组织样品处理：取100mg待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000r/min离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。3.2.2血清样品的处理：用无菌注射器自耳静脉采集血液1-2mL，把血清析出后直接转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。3.3存放与运输采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。4操作方法4.1样品RNA的制备4.1.1取1.5mL灭菌离心管，每管加入300µL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100µL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入100µL氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r/min离心15min。4.1.2吸取离心后各管中的上清液150µL转移至新的1.5mL灭菌离心管中（注意不要吸出中间层），加入150µL－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。4.1.34℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应置于吸水纸不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。4.1.44℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.54℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干3min～5min或室温干燥10min。不宜过于干燥，以免RNA不易溶解。4.1.6加入11µLDEPC处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于－70℃冰箱备用。4.1.7样品RNA制备可采用4.1.1～4.1.6提取方法，也可采用商品化的试剂盒提取。4.2反转录（cDNA的合成）配制反转录反应混合液，反转录反应混合液成份含：M-MLV5×Reactionbuffer(含Mg2+)，4µL；2.5mMdNTPs，4µL；M-MLV，0.5µL；RNA酶抑制剂，0.5µL；反转录引物（JEV-P2，也是RT-PCR反应液中下游引物）1µL；总体积10µL。向每管中分别加入4.1.6中相应RNA10µL，并对每个管进行相应的DB41/T1515—20173编号，37℃水浴1h或置于PCR仪中37℃1h，反应结束后，70℃15min灭活反转录酶，直接用于PCR扩增或-20℃冻存备用。4.3RT-PCR扩增4.3.1在检测区配制与4.2中相同数量的RT-PCR反应体系，PCR反应混合液成分：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2.5µL；2.5mMdNTPs，2µL；JEV-P1，0.5µL；JEV-P2，0.5µL；TaqDNA聚合酶，0.25µL；水，15.25µL；总体积为21µL。4.3.2向每个反应体系加入4.2中相应cDNA4µL，充分混匀后使液体全部聚集于管底，并对每个管进行相应的编号。4.3.3将4.3.1中加样后的RT-PCR反应管放入PCR扩增仪内。4.3.4反应参数设置：94℃5min；94℃45s，52℃45s，72℃45s共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增反应结束后取出放置于4℃。4.44.4.1PCR扩增产物的电泳检侧，称取1.5g琼脂糖加入100mL核酸电泳缓冲液中加热，充分溶化后稍放凉，加入适量的溴化乙锭(终浓度0.5μg/mL)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5～10µLPCR扩增产物分别和3µL上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。5V/cm恒压下电泳30min左右。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。5结果判定5.1试验结果成立条件试验结果成立条件，猪乙型脑炎病毒核酸阳性对照的PCR产物，经电泳后在314bp位置出现特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立（参见附录C）。5.2阳性判在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在314bp位置上出现特异性条带，判定为猪乙型脑炎病毒核酸阳性（参见附录C）。5.3阴性在试验结果成立的前提下，如果314bp位置未出现特异性条带，判定为猪乙型脑炎病毒阴性（参见附录C）。5.4可疑若在314bp位置上条带极弱，应做复核试验，再次出现314bp大小条带判定为猪乙型脑炎病毒核酸阳性，否则判定为阴性。DB41/T1515—20174AA附录A（规范性附录）常规试剂的配制A.11×核酸电泳缓冲液：Tris碱，24.2g；冰乙酸，5.71mL；0.5mol/LEDTA(pH8.0)，10mL；加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为1×核酸电泳缓冲液。A.20.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL。0.01mol/LPBS的配制：A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL；121℃，15min高压灭菌，4℃保存备用。A.3阳性对照样品：经灭活的猪乙脑病毒细胞培养毒。A.4阴性对照样品：BHK21细胞培养液。A.5DEPC水，用0.1%DEPC处理后的去离子水，经121℃15min高压处理，用于溶解RNA。DB41/T1515—20175BB附录B（规范性附录）猪乙型脑炎病毒RT-PCR试验所用引物猪乙脑病毒RT-PCR试验所用引物见表B.1。表B.1猪乙脑病毒病毒RT-PCR试验所用引物引物名称引物浓度引物序列PCR扩增上游引物JEV-P120pmol/L5'-ggatggtgcctgcattgg-3'PCR扩增下游引物JEV-P220pmol/L5'-ccgactccagacaatttttttgt-3'DB41/T1515—20176CCDB41/T1515—20177DD附录C（资料性附录）猪乙型脑炎病毒RT-PCR扩增图猪乙型脑炎病毒RT-PCR扩增图见图C.1。图C.1猪乙型脑炎病毒RT-PCR扩增图注：注P:猪乙型脑炎病毒阳性对照；N：阴性对照；M：DNAMarkerDL2000_________________________________