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ICS65.020.30B41DB41河南省地方标准DB41/T1516—2017犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法2017-12-06发布2018-03-06实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1516—2017I前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，三门峡市动物疫病预防控制中心，鹤壁市畜产品质量监测检验中心，信阳市动物疫病预防控制中心,平顶山市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：闫若潜、班付国、王华俊、赵雪丽、谢彩华、刘梅芬、赵明军。本标准参加起草人：杨晴、孙素芳、曹伟伟、王淑娟、郭育培、王建科、黄清、韩楠、马超锋、朱前磊，杨海波、李方方。DB41/T1516—20171犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqManMGB实时荧光PCR（FQ-PCR）检测样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似CDV、CPV感染动物的唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物、血清等待检样品和死亡动物的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品的病毒核酸检测。2试剂和仪器设备2.1试剂2.1.1拭子悬液（见附录A），组织悬液（见附录A），以上试剂-20℃保存。2.1.2裂解液（TriZol），氯仿，1×核酸电泳缓冲液，0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录A），二乙基焦碳酸酯处理水（DEPC处理水）（见附录A），以上试剂4℃保存。2.1.3异丙醇，75%乙醇，-20℃保存。2.1.4消化液Ⅰ，TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存；消化液Ⅱ（见附录A），阳性对照、阴性对照（见附录A），以上试剂置-20℃保存。2.1.5酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)（见附录A），试剂4℃保存。2.1.6TaqManFQ-PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。2.1.7犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqManFQ-PCR反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。2.2仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），生物安全柜，恒温水浴锅，2℃～8℃冰箱，-70℃冰箱，单道微量移液器（0.1µL～2.5µL，0.5µL～10µL，2µL～20µL，20µL～200µL，100µL～1000µL），组织匀浆器或研钵，真空干燥器（非必备）。3样品采集、处理、存放及运输3.1样品采集及处理3.1.1疑似感染动物样品用拭子采集疑似CDV、CPV感染动物唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物悬液等样品，放入盛有1.0mL拭子悬液（见附录A）的Eppendorf管中，然后将样品悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3.1.2组织样品DB41/T1516—20172组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3.1.3血清样品用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。3.2存放与运送采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。4操作方法4.1样品RNA的制备4.1.1取1.5mL灭菌Eppendorf管，每管加入300µL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100µL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入100µL氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r/min离心15min。4.1.2吸取离心后各管中的上清液150µL转移至新的1.5mL灭菌Eppendorf管中（注意不要吸出中间层），加入150µL－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。4.1.34℃条件下12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应置于吸水纸不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。4.1.44℃条件下12000r/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.54℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干3min～5min或室温干燥10min。不宜过于干燥，以免RNA不易溶解。4.1.6加入11µLDEPC处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于－70℃冰箱备用。4.1.7样品RNA制备可采用上述提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。4.2样品DNA的提取4.2.1取1.5mL无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100µL，再加入500µL消化液Ⅰ和10µL消化液Ⅱ，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；置55℃水浴30min～1h。4.2.2分别加入500µL酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于4℃条件下12000r/min离心10min。4.2.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5mL无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15min。DB41/T1516—201734.2.44℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700µL75%乙醇，轻轻混匀。4.2.54℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4.2.64℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min～5min或室温干燥10min。4.2.7加入10µLTE缓冲液，轻轻混匀，溶解DNA，2000r/min离心5s，置-20℃冻存备用。4.2.8DNA的制备可采用4.2.1～4.2.7提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。4.3反转录（cDNA的合成）4.3.1反转录反应混合液组成：M-MLV5×Reactionbuffer(含Mg2+)，4µL；2.5mMdNTPs，4µL；M-MLV（200U/µL），0.5µL；RNA酶抑制剂（40U/µL），0.5µL；反转录引物（Unit-P）1µL；总体积10µL。4.3.2向每管中加入4.1.6中相应RNA10µL，37℃水浴1h或置于PCR仪中37℃1h，反应结束后，70℃15min灭活反转录酶，直接用于下面的二重FQRT-PCR扩增或－20℃冻存备用。4.4二重实时荧光PCR扩增4.4.1二重实时荧光PCR反应混合液组成：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2.5µL；2.5mMdNTPs，2µL；CDV-P1，0.5µL；CDV-P2，0.5µL；CDV-Probe1.0µL；CPV-P1，0.5µL；CPV-P2，0.5µL；CPV-Probe1.2µL；TaqDNA聚合酶（5U/µL），0.25µL；水，12.25µL；总体积为21µL。4.4.2在检测区配制与4.1、4.2中相同数量的实时荧光PCR反应体系n管，向每管中加入4.3和4.2.5中相应cDNA和DNA各2µL，充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照加样顺序摆放好实时荧光PCR反应管。4.4.3将4.4.1中加样后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪内并记录样本摆放顺序。4.4.4反应参数设置：第一阶段，预变性94℃/5min；第二阶段，94℃/30s，60℃/30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为FAM/NONE和VIC/NONE双标记模式。5结果判定5.1结果分析条件设定阈值设定以阴性对照扩增曲线的最高点为原则，读取检测结果。5.2质量控制标准阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞32.0或无；阳性对照的Ct值应≤29.0，且出现特定的扩增曲线（参见附录C）。5.3结果描述及判定5.3.1阳性DB41/T1516—20174在质量控制标准成立的前提下，样品Ct值≤29.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定为CDV、CPV病毒核酸阳性；出现一条特定的扩增曲线，判定为对应的病毒核酸阳性。5.3.2阴性在质量控制标准成立的前提下，样品Ct值＞32.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为CDV、CPV病毒核酸阴性。5.3.3可疑在质量控制标准成立的前提下，样品29.0＜Ct值≤32.0，且有特定的扩增曲线，样品应重新检测，结果为阳性者判定为病毒核酸阳性，否则判定为病毒核酸阴性。DB41/T1516—20175AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1组织悬液在0.01mol/LPBS液中添加青霉素(2000IU/mL)，链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50pg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)。A.2拭子悬液在0.01mol/LPBS液中添加组织悬液所有的抗生素，浓度提高5倍；加入抗生素后调pH值至7.2～7.4。A.3消化液ⅠTris-HCl（pH8.0）终浓度10mmol/L；EDTA（pH8.0）终浓度25mmol/L；SDS（w/v）终浓度0.5%；NaCl终浓度100mmol/L。A.4TE缓冲液Tris-HCl(pH8.0)终浓度为10mol/L，EDTA(pH8.0)终浓度为1mol/L。A.5酚/氯仿/异戊醇溶液Tris饱和酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合。A.60.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）A.6.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4•H2O27.6g，用适量蒸馏水溶解，定容至1000mL。A.6.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4•12H2O71.6g，用适量蒸馏水溶解，定容至1000mL。A.6.30.01mol/LPBS的配制：A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，用蒸馏水定容至1000mL；121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。A.7消化液Ⅱ称取100mg蛋白酶K溶解于5mL灭菌水中。A.8二乙基焦碳酸酯处理水（DEPC处理水）DB41/T1516—20176用0.1%DEPC处理后的去离子水，经121℃15min高压处理，用于溶解RNA。A.9阳性对照经灭活的CDV、CPV细胞培养物。A.10阴性对照正常VERO细胞和正常MDCK细胞。DB41/T1516—20177BB附录B（规范性性附录）犬温热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法所用引物犬温热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法所用引物见表B.1。表B.1犬温热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法所用引物引物名称引物浓度引物序列PCR扩增上游引物CDV-P120pmol/μL5'-GGATGG