DB41T 1525-2018 猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法

ICS65.020.30B41DB41河南省地方标准DB41/T1525—2018猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法2018-01-03发布2018-04-03实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1525—2018I前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，平顶山市动物疫病预防控制中心，商丘市动物疫病预防控制中心，国家食品药品监管总局。本标准主要起草人：班付国、闫若潜、王翠、谢彩华、王淑娟、王东方、朱前磊。本标准参加起草人：赵雪丽、王华俊、孙素芳、郭育培、陶顺启、刘敏、苑述友、苗连叶、杨海波、王李辉、王一、王磊、钱勇。DB41/T1525—20181猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）实时荧光PCR检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等组织样品及血液样品中病毒核酸的检测。2试剂和仪器设备除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。水为灭菌双蒸水或超纯水。2.1试剂2.1.1组织悬液、消化液Ⅰ、TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存。2.1.2酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)、0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）、1×核酸电泳缓冲液、阿氏液（见附录A），以上试剂4℃保存。2.1.3消化液Ⅱ、阳性对照、阴性对照（见附录A），置-20℃保存。2.1.4PCV2实时荧光PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。2.2仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），二级生物安全柜，恒温水浴锅，2℃～8℃冰箱，－70℃冰箱，组织匀浆器或研钵，单道微量移液器（0.1µL～0.25µL；0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000µL），真空干燥器（非必备）。3样品的采集、处理、存放及运输3.1样品的采集及处理采集疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等靶组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，然后将悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3.2血清和抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液）2mL～3mL，再自耳缘静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无菌Eppendorf管中，编号备用。3.3存放与运送DB41/T1525—20182采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。4操作方法4.1样品DNA的提取4.1.1取1.5mL无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100µL，再加入500µL消化液Ⅰ和10µL消化液Ⅱ，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；置55℃水浴30min～1h。4.1.2分别加入500µL酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于4℃条件下12000r/min离心10min。4.1.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5mL无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15min。4.1.44℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700µL75%乙醇，轻轻混匀。4.1.54℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.64℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干3min～5min或室温干燥10min。4.1.7加入10µLTE缓冲液，轻轻混匀，溶解DNA，2000r/min离心5s，置-20℃冻存备用。4.1.8DNA的制备可采用4.1.1～4.1.7提取方法，也可采用商品化的试剂盒提取。4.2实时荧光PCR扩增4.2.1实时荧光PCR反应混合液组成：10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2.5µL；2.5mMdNTPs，2µL；PCV2FQ-F，0.5µL；PCV2FQ-R，0.5µL；PCV2-Probe，1.0µL；TaqDNA聚合酶，0.25µL；水，14.25µL；总体积为21µL。4.2.2在检测区配制与4.1中相同数量的实时荧光PCR反应体系，向每个实时荧光PCR反应管中加入4.1中相应DNA4µL，充分混匀，使液体全部聚集于管底，按照加样顺序摆放好实时荧光PCR反应管。4.2.3将4.2.1中加样后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪内并记录样本摆放顺序。4.2.4反应参数设置：95℃预变性4min，94℃15s，60℃40s，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为FAM/NONE标记模式。5结果判定5.1结果分析条件设定阈值设定以阴性对照扩增曲线的最高点为原则，读取检测结果。5.2质量控制标准阴性对照的检测结果应无特定扩增曲线，且Ct值＞32.0或无；阳性对照的Ct值应≤29.0，且出现特定扩增曲线（参见附录C）。5.3结果描述及判定DB41/T1525—201835.3.1阳性在质量控制标准成立的前提下，样品Ct值≤29.0，且出现特定扩增曲线，则判定为PCV2核酸阳性。5.3.2阴性在质量控制标准成立的前提下，样品Ct值＞32.0或无，且无特定扩增曲线，判定为PCV2核酸阴性。5.3.3可疑在质量控制标准成立的前提下，样品29.0＜Ct值≤32.0，且有特定的扩增曲线，判定为可疑；可疑样品应重新检测，结果为阳性者判定为PCV2核酸阳性，否则判定为PCV2核酸阴性。DB41/T1525—20184AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1组织悬液在0.01mol/LPBS液中添加青霉素(2000IU/mL)，链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50pg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)。A.2消化液ⅠTris-HCl（pH8.0）终浓度10mmol/L；EDTA（pH8.0）终浓度25mmol/L；SDS（w/v）终浓度0.5%；NaCl终浓度100mmol/L。A.3TE缓冲液Tris-HCl(pH8.0)终浓度为10mol/L，EDTA(pH8.0)终浓度为1mol/L。A.4酚/氯仿/异戊醇溶液Tris饱和酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合。A.5阿氏液葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，溶解后调pH值至6.1，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。A.60.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）A.6.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4•H2O27.6g，用适量蒸馏水溶解，定容至1000mL。A.6.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4•12H2O71.6g，用适量蒸馏水溶解，定容至1000mL。A.6.30.01mol/LPBS的配制：A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，用蒸馏水定容至1000mL；121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。A.7消化液Ⅱ称取100mg蛋白酶K溶解于5mL灭菌水中。A.81×核酸电泳缓冲液DB41/T1525—20185Tris碱，24.2g；冰乙酸，5.71mL；0.5mol/LEDTA(pH8.0)，10mL；加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为1×核酸电泳缓冲液。A.9阳性对照经PK-15细胞培养纯化、灭活的PCV2细胞毒。A.10阴性对照PK-15细胞培养物。DB41/T1525—20186BB附录B（资料性附录）猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法所用引物及探针猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法所用引物及探针见表B.1。表B.1猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法所用引物及探针序列引物名称引物浓度/(pmol/L)引物序列PCR扩增上游引物（PCV2FQ-F）205'-TTTGGCCCGCAGTATTCTG-3'PCR扩增下游引物（PCV2FQ-R）205'-CTGGGACAGCAGTTGAGGAGTA-3'PCR扩增探针（PCV2-Probe）1005'-FAM-TTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGA-TAMRA-3'DB41/T1525—20187CCD附录C（资料性附录）PCV2实时荧光PCR检测方法扩增图PCV2实时荧光PCR检测方法的扩增图见图C.1。注：P：PCV2阳性对照；N：阴性对照图C.1PCV2实时荧光PCR检测方法扩增图_________________________________