DBS44 013-2019 食品安全地方标准 纳豆粉

广东省食品安全地方标准DB44DBS44/013-2019纳豆粉2019-12-01实施2019-07-11发布广东省卫生健康委员会发布DBS44/013-2019I前言本标准为首次发布。DBS44/013-20191纳豆粉1范围本标准适用于纳豆粉。2定义2.1纳豆粉以大豆为原料，添加或不添加其他辅料，经枯草芽孢杆菌发酵、干燥、粉碎等工艺加工而成的粉末状发酵豆制品。3技术要求3.1原料要求3.1.1大豆：应符合GB2715和GB1352的要求。3.1.2所有原辅料：应符合GB2761、GB2762、GB2763、GB2763.1以及相应食品标准的有关规定。3.2感官要求应符合表1的规定。表1感官要求项目要求检验方法色泽浅黄色至黄褐色取适量试样置于白色洁净瓷盘中，在自然光下观察色泽、性状和杂质，闻其气味，品其滋味。气味、滋味具有纳豆粉特有的气味、滋味，无异味性状粉末状，无结块杂质无正常视力可见外来杂质3.3理化指标应符合表2规定。表2理化指标项目要求检验方法纳豆激酶aFU/g≥2000附录A紫外分光光度法IU/g≥13000附录B琼脂糖纤维蛋白平板法DBS44/013-20192蛋白质b，g/100g≥20GB5009.5水分，g/100g≤7.0GB5009.3灰分，g/100g≤6.0GB5009.4a纳豆激酶用附录A或附录B其中一个方法检测符合相应要求即视为合格。b氮折算成蛋白质的系数，以6.25计。3.4污染物限量应符合表3的规定。表3污染物限量项目要求检验方法铅（以Pb计），mg/kg≤0.5GB5009.123.5真菌毒素限量应符合表4的规定。表4真菌毒素限量项目要求检验方法黄曲霉毒素B1，μg/kg≤5.0GB5009.223.6微生物限量应符合表5的规定。表5微生物限量项目采样方案a及限量检验方法ncmM大肠菌群，CFU/g521001000GB4789.3平板计数法沙门氏菌，/25g500--GB4789.4金黄色葡萄球菌，CFU/g511001000GB4789.10第二法a样品的采样及处理按GB4789.1和GB/T4789.21执行。n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品数；m为致病菌指标可接受水平的限量值；M为致病菌指标的最高安全限量值。3.7食品添加剂要求3.7.1食品添加剂的使用应符合GB2760对发酵豆制品的规定。DBS44/013-20193附录A纳豆激酶测定方法--紫外分光光度法A.1范围本方法适用于纳豆粉中纳豆激酶的测定。本方法的检测浓度范围为0.67~1.33FU/mL。A.2原理纳豆粉中的纳豆激酶与纤维蛋白发生反应，使纤维蛋白肽键水解。水解反应使溶液在紫外光275nm处吸光度发生变化。用紫外分光光度计测定水解反应前后吸光度的变化，通过换算间接得出纳豆激酶的活力，单位用FU表示。一个活力单位（1FU）是指在275nm下，使吸光度值每增加0.01时消耗的酶量。A.3试剂配置A.3.1实验用水为一级水。A.3.2磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：分析纯；A.3.3磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）：分析纯；A.3.4氯化钠（NaCl）：分析纯；A.3.5盐酸（HCl）：分析纯；A.3.6三氯乙酸（TCA）：分析纯；A.3.7纤维蛋白原：CAS：9001-32-5，SIGMA，提取自牛血浆，产品编号F8630，规格：5g/瓶，含量：65-85%；A.3.8凝血酶：CAS：9002-04-4，SIGMA，提取自牛血浆，产品编号T4648，规格：21.6mg/瓶，含量：1KU；A.3.9醋酸（CH3COOH）：分析纯；A.3.10醋酸钠（CH3COONa·3H2O）：分析纯；A.3.11TritonX-100：分析纯；A.3.12硫酸钙（CaSO4·2H2O）：分析纯；A.3.130.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.8，含NaCl）精密称取3.58g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），加水溶解并稀释定容至1.0L，配成溶液A，精密称取0.78g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)，加水溶解并稀释定容至500mL，配成溶液B，将溶液A和B混合，配成pH值为7.5的磷酸缓冲溶液（约取A液84mL，16mLB液）；取上述pH值为7.5的磷酸缓冲溶液与0.9%的氯化钠溶液混合，混合比例约为1:17，配成pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液。DBS44/013-20194A.3.140.2mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：精密称取32.68gTCA，用适量去离子水溶解并稀释至1000mL即得。A.3.150.96％纤维蛋白原溶液：移取10mL磷酸盐缓冲液（0.01mol/L）至锥形瓶中，加入96mg纤维蛋白原。超声使其完全溶解，防止起泡。A.3.16凝血酶溶液：临用前用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释50倍。A.3.171mol/L醋酸溶液：精密称取60.1gCH3COOH，用适量去离子水溶解并稀释至1000mL即得。A.3.181mol/L醋酸盐缓冲液（pH6.0）：精密称取129.6gCH3COONa·3H2O，用约500mL去离子水溶解，向其中加入1mol/L醋酸溶液至pH=6.0后，用去离子水稀释至1000mL即得。A.3.1910％TritonX-100溶液：称取10gTritonX-100，在加热条件下用适量去离子水溶解，再补加去离子水至100mL即得。A.3.20稀释剂：精密称取0.334g（终浓度2mmol/L）CaSO4·2H2O和0.585g（终浓度10mmol/L）NaCl，用适量去离子水溶解，向其中加入1mol/L醋酸盐缓冲液2.0mL（pH6.0）以及10％TritonX-100溶液0.5mL（最终浓度为0.005％）后，用去离子水稀释至1000mL即得。A.4仪器和设备A.4.1水浴锅：（37±0.5）℃；A.4.2分析天平，感量为0.1mgA.4.3超纯水仪A.4.4pH计A.4.5涡旋混合器A.4.6离心机，转速≥12000转/minA.4.710mL离心管A.4.8紫外可见分光光度计，配1cm石英比色皿A.5测试A.5.1样品溶液制备准确称取适量样品（称样量根据不同样品中纳豆激酶的含量而定，大约保证样品溶液中纳豆激酶浓度在0.67~1.33FU/mL之间），用稀释剂溶解，使最终反应液的校正吸光度（ΔA）在0.04~0.08之间。A.5.2测定A.5.2.1样品管DBS44/013-20195A.5.2.1.1将1.4mL0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.4mL0.96％纤维蛋白原溶液加至10mL离心管中，37±0.5℃水浴中孵育5min。A.5.2.1.2取出加入0.1mL凝血酶溶液并均匀混合。至37±0.5℃水浴中孵育10min。A.5.2.1.3取出加入0.1mL样品溶液，涡旋混合5s，至37±0.5℃水浴中孵育60min。在分别达到孵育20min和40min时间点时，分别取出在涡旋混合器上再均匀混合5s后，继续孵育。A.5.2.1.4至反应60min时，加入2mL0.2mol/LTCA终止反应液。将加过终止反应液的样品管继续混合均匀5s后，于37℃±0.5℃继续孵育20min，使终止反应完全。A.5.2.1.5取出样品液进高速离心机，在12000rpm条件下离心10min。A.5.2.1.6用移液管小心移取2mL上清液至比色皿中，并于275nm处测定吸光度（A）。A.5.2.2样品空白管A.5.2.2.1与样品管A.5.2.1.1和A.5.2.1.2同样操作。A.5.2.2.2取出加入2mL0.2mol/LTCA终止反应液，均匀混合5s。A.5.2.2.3加0.1mL样品溶液，均匀混合5s后，放入37℃±0.5℃水浴中孵育20min。A.5.2.2.4接A.5.2.1.5和A.5.2.1.6操作，得样品空白管吸光度（A0）。A.6结果计算样品中纳豆激酶X（FU/g）按以下公式计算：X=（A-A0）/(0.01×60×0.1)×D式中：A——样品液吸光度；A0——空白管吸光度；D——样品的稀释率，D=定容体积（mL）/称样量（g）；计算结果表示到小数点后两位。A.7检测质量控制标准在重复性条件下获得的独立测定结果的相对标准偏差不得超过20%。A.8分析步骤的关键控制点及说明A.8.1稀释剂可在室温下保存15天。过期重配。A.8.2样品溶液浑浊时需过滤，取滤液测试。A.8.3混合均匀操作需配合使用搅拌器。A.8.4要严格控制酶解反应时间。A.8.5酶对样品反应的影响较大。当实验更换了一批纤维蛋白原和凝血酶后，对同一批样品而言，结果有所不同。DBS44/013-20196附录B纳豆激酶测定方法--琼脂糖纤维蛋白平板法B.1范围本方法适用于纳豆粉中纳豆激酶的测定。B.2原理纳豆激酶同尿激酶一样，是具有纤溶活性的物质。在含有凝血酶和纤维蛋白原琼脂糖平板的固体支架上，样品中的纳豆激酶和尿激酶标准系列同时发生溶纤反应，形成透明溶圈。以溶圈面积大小的对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归曲线，得出相应的回归方程。根据回归方程计算样品中尿激酶活性大小。样品中的纳豆激酶以尿激酶活性大小IU计。B.3试剂与试液实验用水为符合GB/T6682规定的一级水。B.3.1试剂B.3.1.1磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：分析纯；B.3.1.2磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）：分析纯；B.3.1.3氯化钠（NaCl）：分析纯；B.3.1.4琼脂糖B.3.1.5纤维蛋白原（来源牛血）：CAS：9001-32-5；B.3.1.6凝血酶（来源牛血）：CAS：9002-04-4；B.3.1.7尿激酶：中国食品药品检定研究院B.3.2试液配制B.3.2.1PBS缓冲液的制备：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）3.58g，加双蒸水使溶解并稀释至1000mL为Ⅰ液；取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.78g加双蒸水使溶解并稀释至500mL为Ⅱ液；将两液混合，调节至pH值为7.5（Ⅰ液取约84mL，Ⅱ液取约16mL）；0.9%氯化钠溶液：称取氯化钠9g，定容至1L，得到0.9%氯化钠溶液。将0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）与0.9%氯化钠溶液（1:17）混合，得到PBS缓冲液。B.3.2.21.5%琼脂糖溶液：取琼脂糖1.5g，加PBS缓冲液100mL，加热溶解，50℃水浴保温。现配现用。B.3.2.3纤维蛋白原溶液DBS44/013-20197取纤维蛋白原适量，加PBS缓冲液制成每1mL中含1.5mg蛋白的纤维蛋白原溶液。注意：缓慢加入PBS缓冲液，防止产生气泡，加冰超声溶解。B.3.2.4凝血酶溶液取凝血酶适量，加入0.9%氯化钠溶液制成每1mL中含1-2U或1-2BP单位的溶液（根据不同试剂标签标识单位而定）。B.3.2.5尿激酶标准系列溶液的制备：取尿激酶标准品，按标示效价加入所需PBS缓冲液溶解，配制的尿激酶标准溶液为1000IU/mL，按表B.1继续配制尿激酶标准系列溶液。表B.1尿激酶标准系列溶液配制尿激酶对照系列溶液浓度IU/mL尿激酶对照溶液取样量μLPBS缓冲液取样量μL1000100080080206006040500505040040602002080100109050101902510390注：稀释后的各标准溶液管应采用涡旋震荡器混合均匀。B.4仪器和设备B.4.1游标卡尺B.4.2恒温水浴锅B.4.3超纯水仪B.4.4恒温培养箱B.4.5涡旋混合器B.4.6电子分析天平B.4.7可调控电炉B.4.8超声仪DBS44/013-20198B.4.9培养皿（内径14cm）B.4.10打孔器（直径3mm）B.5分析步骤B.5.1样品溶液的制备：取纳豆粉样品适量（正式检验前有预知大约含量），加适量PBS缓冲溶解，样液浓度稀释至200~400IU/mL左右。超声提取15min后定容至容量瓶刻线。B.5.2纤维蛋白平板的制备：取B.3.2.3纤维蛋白