DBS32 014-2017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测

DBS江苏省地方标准DBS32/014—2017食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测2017-11-27发布2017-11-27实施江苏省卫生和计划生育委员会发布DBS32/014—2017I前言本标准系首次发布。DBS32/014—20171食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品、巧克力类及可可制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品、即食调味品、坚果籽实制品等食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的快速检测。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1实时荧光PCR仪。2.2冷冻离心机：12000r/min，4ºC。2.3均质器。2.4恒温空气振荡摇床：36ºC±1ºC、30ºC±1ºC、42ºC±1ºC。2.5恒温水浴锅：95ºC±1ºC。2.6天平：感量0.01g。2.7冰箱：2ºC~5ºC、-20ºC。2.8微量移液器：0.1μL-2.5μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL。2.9灭菌吸头：10μL、200μL、1000μL。2.10厌氧培养装置。2.11灭菌1.5mL离心管。3试剂与培养基3.1PCR实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，121ºC高压灭菌30min。3.2TaqDNA聚合酶：5U/μL。3.3脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：10mmol/L。3.4DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加入灭菌蒸馏水定容至100mL，保存于-20ºC备用；或使用商品化的DNA提取试剂盒。3.510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。3.6引物和探针：引物和探针序列见附录A，加水稀释至10μmol/L，其中探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。3.7培养基3.7.17.5%氯化钠肉汤：见GB4789.10。DBS32/014—201723.7.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见GB4789.4。3.7.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB4789.4。3.7.4四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见GB4789.4。3.7.5李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB4789.30。3.7.6改良EC肉汤（mEC+n）：见GB4789.36。3.7.73%氯化钠碱性蛋白胨水：见GB4789.7。3.7.8志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB4789.5。4操作步骤4.1样品制备和增菌培养4.1.1金黄色葡萄球菌样品处理步骤按照GB4789.10进行，将处理后的7.5%氯化钠肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.2沙门氏菌样品处理步骤按照GB4789.4进行，将处理后的BPW样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC、200r/min振摇4h。从培养后的样品匀液中移取1mL，转接种于10mLSC增菌液，置于36ºC±1ºC恒温空气振荡摇床，200r/min振摇4h。另取1mL，转接种于10mLTTB增菌液，置于42ºC±1ºC恒温空气振荡摇床，200r/min振摇4h。4.1.3单核细胞增生李斯特氏菌样品处理步骤按照GB4789.30进行，将处理后的LB1样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，30ºC±1ºC、200r/min振摇4h；移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，30ºC±1ºC，200r/min振摇4h。4.1.4大肠埃希氏菌O157：H7样品处理步骤按照GB4789.36进行，将处理后的改良EC肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.5副溶血性弧菌样品处理步骤按照GB4789.7进行，将处理后的3%氯化钠碱性蛋白胨水样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36ºC±1ºC，200r/min振摇8h。4.1.6志贺氏菌样品处理步骤按照GB4789.5进行，将处理后的志贺氏菌增菌肉汤样品匀液放置于厌氧培养装置中，41.5ºC±1ºC厌氧培养8h。4.2致病菌DNA提取分别取4.1培养后的增菌液1mL，加入1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，吸弃上清；加入50μLDNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后置于95ºC±1ºC水浴5min，12000r/min，4ºC离心5min，取上清，-20ºC保存，作为模板DNA备用。注：也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。DBS32/014—201734.3实时荧光PCR检测4.3.1配置PCR反应体系（25μL）：10×PCR缓冲液2.5μL，引物各0.5μL，探针1μL，dNTP1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，无菌水17μL，模板DNA2μL。4.3.2反应条件：95ºC预变性30s；94ºC变性5s，60ºC退火延伸40s，进行40个循环。注：PCR反应参数可根据PCR仪型号的不同进行适当的调整。4.3.3检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为阳性标准菌株DNA，阴性对照为用无菌水代替样品进行增菌得到的DNA提取液，空白对照为无菌水。4.4实验结果与判定阳性对照应出现典型扩增曲线，Ct值30；同时，阴性对照和空白对照应无扩增曲线，Ct值≥40；否则，实验视为无效，需重新实验。实验结果Ct值≥40，可判定样品结果为阴性，直接报告目标致病菌未检出；Ct值≤35，样品结果为阳性；Ct值35而40，为可疑结果。阳性结果与可疑结果须按照相应GB4789标准进行检验，根据国家标准方法得出的结果判定。4.5检测过程中防止交叉污染及生物安全要求检测过程中防止交叉污染按照GB/T27403中的规定执行，实验室生物安全要求应符合GB19489的规定。DBS32/014—20174AA附录A（规范性附录）致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列A.1致病菌实时荧光PCR法中所用的引物探针序列见表A.1。表A.1致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列致病菌名称引物序列探针序列靶基因名称及GenBank编码副溶血性弧菌5’-GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGT-3’5’-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3’VP0819(NC_004603.1)5’-CATTCGCGTGGCAAACATC-3’金黄色葡萄球菌5’-AAATTACATAAAGAACCTGCGACA-3’5’-AATTTAACCGTATCACCATCAATCGCTTT-3’SAOUHSC_00818(NC_007795.1)5’-GAATGTCATTGGTTGACCTTTGTA-3’单核细胞增生李斯特氏菌5’-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3’5’-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3’iap(NC_003210.1)5’-CGCGACCGAAGCCAACTA-3’沙门氏菌5’-CCAGTTTATCGTTATTACCAAAGG-3’5’-CTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACA-3’invA(NC_003197.2)5’-ATCGCACCGTCAAAGGTC-3’大肠埃希氏菌O157：H75’-TTTCATACTTATTGGATGGTCTCAA-3’5’-AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTAAGG-3’ECs2841(NC_002695.1)5’-CGATGAGTTTATCTGCAAGGTGAT-3’志贺氏菌5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’5’-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3’ipaH4.5(NC_007607.1)5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’_________________________________