DBS22 018-2013 食品安全地方标准 鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测 PCR方法

DBS22吉林省地方标准DBS22/018—2013食品安全地方标准鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测PCR方法2013-10-08发布2013-10-08实施吉林省卫生厅发布DBS22/018—2013I前言本标准的附录A为资料性附录。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学。本标准主要起草人：史艳宇，刘金华，邴炜，华蕾，王莹，金哲勇，张庆波，吕航，赵立群。DBS22/018—20131食品安全地方标准鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测PCR方法1范围本方法规定了鲜（冻）畜肉中鸭源性成分的PCR定性分析方法。本方法适用于生鲜、冷冻畜肉中鸭源性成分定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。4原理对样品进行DNA提取，通过PCR扩增，检测鸭特异性基因片段。5试剂和材料除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1鸭源性成分检测用引物（对）序列为：上游引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’下游引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3限制性内切酶：StuI酶。5.4dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.5食物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.6分子量标记：100bp~3000bpDNAMarker。5.7CTAB裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LTris-HCl（pH8.0）[Tris-：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]，0.7mol/LNaCl，0.01mol/LEDTA（pH8.0）(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)。5.8CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化钠0.04mol/L，pH8.0，高压灭菌。DBS22/018—201325.9氯化钠溶液：1.2mol/L。5.10蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.11三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等有机试剂。5.1210×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.13琼脂糖：电泳纯。5.14电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。5.15溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。5.16加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液。5.17酶切缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH7.5），10mmol/LMgCl2，50mmol/LNaCl，0.1mg/mLBSA。6仪器和设备6.1PCR仪。6.2生物安全柜。6.3恒温水浴锅。6.4离心机：转速≥12000r/min。6.5移液器：0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7电泳仪。6.8凝胶成像系统。6.9搅碎机。6.10pH计。6.11天平：感量0.01g。6.12振荡器。6.13冰箱：-20℃～2℃。6.14高压灭菌器。6.15干热灭菌器。6.16离心管：1.5mL、2mL。7采样7.1采样工具下列采样工具应经160℃±2℃，2h高温灭菌：剪刀、镊子、钎子。7.2样品采集与储运待检样品装入一次性密闭的塑料袋内或其他清洁容器（一个采样点的样品放入一个塑料袋或容器），编号，冷藏保存和运输。7.3试样制备与保存DBS22/018—20133生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500g作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。8检测步骤8.1DNA提取和纯化8.1.1CTAB法称取500mg待检试料于2mL离心管中，加入1mLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K溶液，65℃温育1h，期间震荡混匀3~5次，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；12000r/min离心5min，取1mL上清于2mL离心管中，加700μL三氯甲烷，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，收集600μL~650μL上清液到新的2mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温60min；12000r/min离心5min，去除上清液，加350μL氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，转移上清液到新的离心管。加0.8倍体积异丙醇，室温20min，12000r/min离心10min，加500μL70%乙醇水溶液，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，去除上清液，室温条件下过夜或者60℃烘15min~25min，注意不要让沉淀过干。加50μL去离子水溶解沉淀，-20℃保存。8.1.2试剂盒法采用商品化的食品基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5~2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约10ng/μL~50ng/μL。501000ANc.........................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。8.3PCR检测8.3.1PCR反应体系PCR反应体系见表1。每个样品设置2个平行。DBS22/018—20134表1PCR反应体系试剂加入量（μL）10×PCR缓冲液2.5dNTP溶液(10mmol/L)0.5TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2上游引物(10μmol/L)1.0下游引物(10μmol/L)1.0DNA模板（50ng/μL)2.0补水至258.3.2PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR扩增空白对照、PCR扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。用已知含有鸭源性成分的样品作阳性对照，用已知不含有鸭源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。8.3.3PCR扩增产物电泳检测取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5µL~8μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用100bpDNAMarker作参照。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.3.4限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应或进行测序（序列参考附录A）。酶切反应体系（20μL）：StuI酶2U，酶切缓冲液2μL，加入PCR扩增产物至总体积20μL。酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见8.3.3。9结果判断与表述9.1PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201bp（序列参考附录A）。9.2限制性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶StuI酶切后，酶切片段大小为118bp和83bp。9.3结果表述PCR产物为阳性，同时酶切结果正确者判为含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。DBS22/018—2013510检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物无害化处理。DBS22/018—20136AA附录A（资料性附录）PCR产物测序结果CATCTATCCTGCTAGCCGCCGGCCTCTTATCAATGCTCCTAGTGATACTCCAATGATGACGGGACATTGTCCGAGAGAGCACCTTCCAAGGCCACCACACACCTACAGTCCAAAAAGGCCTACGATACGGCATAATCCTCTTCATCACATCCGAAGCTTTCTTCTTCCTAGGATTTTTCTGGGCATTCTTCCACTCAAGCC_________________________________