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DBS22吉林省地方标准DBS22/016-2013食品安全地方标准水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）的测定ELISA法2013-10-08发布2013-10-08实施吉林省卫生厅发布DBS22/016—2013I前言本标准起草单位：长春市水产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：闫先春、杨炳坤、杨立军、王雅倩、修磊。DBS22/016—20131食品安全地方标准水产品中呋喃唑酮代谢物(AOZ)的测定ELISA法1范围本标准规定了水产品中呋喃唑酮代谢物（3-amina-2-oxazolldinone,AOZ）的酶联免疫测定方法。本标准适用于水产品的快速筛选检测。本标准的检出限为0.1µg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法SC/T3016-2004水产品抽样方法3原理利用ELISA抗原抗体的特异性反应，样本中残留的AOZ经衍生化后和酶标板上预包被的偶联抗原竞争呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗显色后，样本吸光值与其所含残留物AOZ的含量成负相关，外标法定量。4试剂与材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682一级水的标准。4.1乙酸乙酯。4.2正己烷。4.3磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）。4.4浓盐酸。4.5氢氧化钠。4.6磷酸氢二钾溶液（0.1moL/L）:称取22.8g磷酸氢二钾，1000mL水溶解混匀。4.71moL/L盐酸溶液:量取8.3mL浓盐酸加入水定容至100mL。4.81moL/L氢氧化钠溶液:称取4.0g氢氧化钠加100mL水溶解混匀。4.9衍生化试剂（10mmoL/L）：向装有15.1mg2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加10mL甲醇溶解混匀。4.10试剂盒提供试剂包括：抗体预包被的96孔板，AOZ标准溶液、AOZ抗体工作液、底物显色剂、酶标记物、反应终止液、浓缩复溶液、洗涤缓冲液。4.11刻度移液管：10mL。4.12洗耳球。4.13玻璃试管：10mL。DBS22/016—201324.14聚苯乙烯离心管：2mL、50mL。5仪器与设备5.1酶标仪或酶联免疫分光光度计(450nm)。5.2天平：感量0.01g。5.3洗板机。5.4旋转蒸发仪/氮气吹干装置。5.5均质器。5.6振荡器。5.7涡旋仪。5.8离心机（4000r/min）。5.9微量移液器：单道20µL～200µL、100µL～1000µL、多道250µL。6测定方法6.1制备与保存6.1.1抽样：按SC/T3016-2004的方法进行。6.1.2样品经处理后，取可食部分（苗种取全身）100g，用均质器捣碎，装入样品袋，标明标记，放入-18℃冰柜中冷冻保存。6.2提取、纯化6.2.1称取1.0±0.05g的均质物（鱼/虾）至50mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL水，0.5mL1mol/L盐酸溶液（4.7）和100µL衍生化试剂（4.9），充分振荡2min；在60℃孵育3h；6.2.2分别加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.6），0.4mL1mol/L氢氧化钠（见4.8）和5mL乙酸乙酯，剧烈振荡30s；3000r/min，温度20℃～25℃离心10min；6.2.3取出2.5mL上层有机相至10mL玻璃试管中，50℃～60℃水浴氮气流下吹干；用1mL正己烷溶解干燥物，用1mL复溶液工作液（4.10）充分混合;高脂肪样本，可加大正己烷用量，用3mL正己烷溶解干燥物。在室温下（20℃～25℃）3000r/min离心10min；除去上层有机相，取50µL下层水相用于分析。6.3测定6.3.1将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20℃～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。6.3.2取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2℃～8℃。6.3.3将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。6.3.4加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本50µL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。6.3.5洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（4.10）250µL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。DBS22/016—201336.3.6加酶标二抗：加入酶标二抗工作液100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6.3.5。6.3.7显色：先后加入两种底物液各50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。6.3.8测定：加入终止液50µL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm，在5min内读完数据，测定每孔OD值。7结果计算标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值除以空白样品的吸光度值，再乘以100%，见式（1）：%E=0AA%100………………………………………（1）式中：E——-百分吸光度值，%；A——-标准液或样品液吸光度值；A0——空白样品吸光度值。以百分比吸光度值为纵坐标，以AOZ标准液浓度对数值为横坐标，建立标准曲线。从标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的AOZ浓度，再乘以其相应的稀释倍数（2倍），即为样品中AOZ浓度。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。_________________________________