DB63T 1709-2018 牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程

ICS65.020.30B43DB63青海省地方标准DB63/T1709—2018牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程2018-12-26发布2019-03-20实施青海省市场监督管理局发布DB63/T1709—2018I前言本标准依据GB/T1.1—2009的规则编写。本标准由青海省农牧业标准化专业技术委员会提出并归口。本标准起草单位：青海省畜牧兽医科学院。本标准主要起草人：徐惊涛、孙永刚、李瑞哲。DB63/T1709—20181牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程1范围本标准规定了牦牛胚胎快速冷冻和解冻的操作方法。本标准适用于牦牛胚胎生产技术推广应用的规范化操作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T25881牛胚胎GB/T26938牛胚胎生产技术规程NY/T1572牛胚胎移植技术规程DB63/T1163牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牦牛胚胎yakembryo通过自然交配、人工授精、体外受精等方式产生的牦牛早期受精卵（受精后6d～8d）。3.2胚胎快速冷冻embryorapidcryopreservation经过清洗、胚胎冷冻保护剂平衡后，将胚胎直接置入液氮中保存的一种冷冻方法。3.3胚胎解冻thawingoffrozenembryo将冷冻保存的胚胎按照操作程序融化，去除冷冻保护剂，使胚胎恢复活性的过程。4试剂、耗材、设备和实验室要求4.1试剂、耗材和设备DB63/T1709—20182所用的试剂、耗材和设备以及要求见附录A。4.2实验室要求冷冻保存液、解冻液及移植液必须在符合GB19489相关条款的实验室中配制。4.3器具清洗、消毒所用器具的清洗、消毒见附录B。5试剂配制及保存5.1试剂配制用水试剂配制用水按照GB/T6682中的分级标准采用一级水。5.2冷冻保存液5.2.1基础液（BS）TCM-199中加入20%胎牛血清（FBS）。5.2.2平衡液（ES）TCM-199中加入7.5%乙二醇（EG）、7.5%二甲基亚砜（DMSO）、20%胎牛血清（FBS）。5.2.3冷冻液（VS）TCM-199中加入15%乙二醇（EG）、15%二甲基亚砜（DMSO）、0.5mol/L蔗糖（Su）、20%胎牛血清（FBS）。5.3胚胎解冻液5.3.1解冻液（TS）TCM-199中加入1.0mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。5.3.2稀释液（DS）TCM-199中加入0.5mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。5.4改进PBS液（m-PBS）改进PBS液（m-PBS）配制见附录C。5.5胚胎移植液（TM）m-PBS中加入4mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和10%胎牛血清（FBS）。5.6解冻后胚胎培养液TCM-199液中加入10%胎牛血清（FBS）和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。5.7试剂保存DB63/T1709—201835.7.1基础液、平衡液、冷冻液、解冻液、胚胎移植液等试剂在无菌操作台中配制，配制后的试剂用0.22μm滤膜过滤除菌后分别装入无菌离心管内，密封管口，在管外标注液体名称、配制日期，存入0℃～4℃冰箱或冷藏箱中保存。5.7.2每次装、取液后，均须即时封闭试剂保存管管口。5.7.3试剂的使用期限为7d以内。6胚胎生产按照GB/T26938和DB63/T1163相关技术操作规程生产。7胚胎冷冻及解冻前准备7.1胚胎冷冻、解冻操作室操作室应设在牦牛胚胎采集或移植附近的场所，室内温度18℃～25℃，封闭性良好，避免阳关直射，提前清理好环境卫生，对操作台用75%酒精进行消毒。7.2操作人员卫生安全清洗双手并用75%酒精消毒，佩戴一次性口罩和手套，穿着消毒后的工作服，进行胚胎冷冻、解冻操作。7.3冷冻、解冻前胚胎预备7.3.1将采集到的牦牛胚胎及时送至操作室，置于恒温平台上，按照本规程8规定的方法在体视显微镜下进行胚胎分拣和分类。7.3.2冷冻胚胎解冻时，将装有冷冻胚胎的液氮罐置于操作室内，按照本规程10规定的方法操作。8冷冻前胚胎分级8.1按照GB/T25881对牦牛胚胎分级评定、筛选。8.2A级、B级和C级胚胎均为可用胚胎，D级为不可用胚胎。A级、B级适于移植或冷冻保存；C级仅适用于鲜胚移植。9胚胎快速冷冻9.1将装有基础液（BS）、平衡液（ES）、快速冷冻液（VS）的离心管从冷藏箱内取出，置于25℃温水中水浴20min。9.2将适量液氮倒入泡沫箱中。9.3在胚胎快速冷冻管和冷冻管包装袋（桶）上标注胚胎来源、品种、生产批号、胚胎数量、胚胎发育期、胚胎级别、存入时间等。9.4取出直径35mm的一次性培养皿3个，在外底部分别标注BS、ES、VS，用移液器加入相应的液体各3mL。9.5在配有显微镜恒温板的体视显微镜下，将分类、分检后的A级、B级胚胎放入BS液中，通过在BS液内移动位置3次，然后静置2min～3min的方式进行清洗。DB63/T1709—201849.6将清洗后的胚胎移入ES液中，并在平衡液中移位2次后，放置平衡3min。9.7将平衡后的胚胎移入VS液中15s～20s后，在40s内将胚胎移至胚胎快速冷冻管（Cryotop）管片上，迅速浸入泡沫箱中的液氮中。9.8在泡沫箱的液氮中用镊子将胚胎快速冷冻管管片端插入套管后，放入冷冻管保存袋（桶）中，将冷冻管保存袋（桶）置于符合GB/T5458规定的液氮罐中保存。10胚胎解冻10.1将胚胎解冻液（TS）、稀释液（DS）、基础液（BS）和胚胎移植液（TM）从冷藏箱内取出，置于38℃温水中水浴20min。10.2在35mm无菌培养皿外底部分别标注TS、DS、BS和TM，每种液体在使用前1min内，用移液器在培养皿中各注入3mL相应的液体，用于胚胎解冻、清洗、移植等。10.3将快速冷冻管Cryotop从液氮罐中取出，放入泡沫箱内的液氮中，取掉冷冻管套管，迅速将存放有胚胎的一端浸入TS中，静置解冻1min。10.4在显微镜下将解冻后的胚胎检出后移入DS中静置5min，然后移入BS中移动清洗3次。10.5将清洗后的胚胎移入TM液中，按照移植液、空气、移植液+胚胎、空气、移植液分段装入0.25mL胚胎细管中，用聚乙烯醇（PVA）细管封口粉封闭前端管口，按照NY/T1572相关规程进行胚胎移植。10.6如操作室有二氧化碳培养箱，需进行解冻后的胚胎培养筛选时，解冻操作前在35mm培养皿中制作覆盖有石蜡油的100μL胚胎培养液微滴，置于5%CO2、38.5℃、饱和湿度的培养箱中平衡2h。将清洗后的胚胎移入胚胎培养液微滴中，在培养箱内培养2h后，检查筛选出活力良好的胚胎，放入胚胎移植液中，按照本规程10.5的规定装入0.25mL胚胎细管，用于移植。_________________________________