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书书书!#$%&’’()*犌犅４７８９．４—２０１６!#$%&’(!)*+,-. /012-.２０１６１２２３34２０１７０６２３56!#$%&’’(+,&-.,/012’(34546789:;34书书书犌犅４７８９．４—２０１６Ⅰ 前 言 本标准代替ＧＢ４７８９．４—２０１０《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、ＳＮ０１７０—１９９２《出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法》、ＳＮ／Ｔ２５５２．５—２０１０《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第５部分：沙门氏菌检验》。整合后的标准与ＧＢ４７８９．４—２０１０相比，主要变化如下：———修改了检测流程和血清学检测操作程序；———修改了附录Ａ和附录Ｂ。犌犅４７８９．４—２０１６１ 食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验１ 范围本标准规定了食品中沙门氏菌（犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。２ 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：２．１ 冰箱：２℃～５℃。２．２ 恒温培养箱：３６℃±１℃，４２℃±１℃。２．３ 均质器。２．４ 振荡器。２．５ 电子天平：感量０．１ｇ。２．６ 无菌锥形瓶：容量５００ｍＬ，２５０ｍＬ。２．７ 无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器及吸头。２．８ 无菌培养皿：直径６０ｍｍ，９０ｍｍ。２．９ 无菌试管：３ｍｍ×５０ｍｍ、１０ｍｍ×７５ｍｍ。２．１０ ｐＨ计或ｐＨ比色管或精密ｐＨ试纸。２．１１ 全自动微生物生化鉴定系统。２．１２ 无菌毛细管。３ 培养基和试剂３．１ 缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）：见Ａ．１。３．２ 四硫磺酸钠煌绿（ＴＴＢ）增菌液：见Ａ．２。３．３ 亚硒酸盐胱氨酸（ＳＣ）增菌液：见Ａ．３。３．４ 亚硫酸铋（ＢＳ）琼脂：见Ａ．４。３．５ ＨＥ琼脂：见Ａ．５。３．６ 木糖赖氨酸脱氧胆盐（ＸＬＤ）琼脂：见Ａ．６。３．７ 沙门氏菌属显色培养基。３．８ 三糖铁（ＴＳＩ）琼脂：见Ａ．７。３．９ 蛋白胨水、靛基质试剂：见Ａ．８。３．１０ 尿素琼脂（ｐＨ７．２）：见Ａ．９。３．１１ 氰化钾（ＫＣＮ）培养基：见Ａ．１０。３．１２ 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见Ａ．１１。３．１３ 糖发酵管：见Ａ．１２。３．１４ 邻硝基酚βＤ半乳糖苷（ＯＮＰＧ）培养基：见Ａ．１３。３．１５ 半固体琼脂：见Ａ．１４。犌犅４７８９．４—２０１６２ ３．１６ 丙二酸钠培养基：见Ａ．１５。３．１７ 沙门氏菌Ｏ、Ｈ和Ｖｉ诊断血清。３．１８ 生化鉴定试剂盒。４ 检验程序沙门氏菌检验程序见图１。图１ 沙门氏菌检验程序犌犅４７８９．４—２０１６３ ５ 操作步骤５．１ 预增菌无菌操作称取２５ｇ（ｍＬ）样品，置于盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质杯或合适容器内，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或置于盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需调整ｐＨ，用１ｍｏｌ／Ｌ无菌ＮａＯＨ或ＨＣｌ调ｐＨ至６．８±０．２。无菌操作将样品转至５００ｍＬ锥形瓶或其他合适容器内（如均质杯本身具有无孔盖，可不转移样品），如使用均质袋，可直接进行培养，于３６℃±１℃培养８ｈ～１８ｈ。如为冷冻产品，应在４５℃以下不超过１５ｍｉｎ，或２℃～５℃不超过１８ｈ解冻。５．２ 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＴＴＢ内，于４２℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。同时，另取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＳＣ内，于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。５．３ 分离分别用直径３ｍｍ的接种环取增菌液１环，划线接种于一个ＢＳ琼脂平板和一个ＸＬＤ琼脂平板（或ＨＥ琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板），于３６℃±１℃分别培养４０ｈ～４８ｈ（ＢＳ琼脂平板）或１８ｈ～２４ｈ（ＸＬＤ琼脂平板、ＨＥ琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表１。表１ 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌ＢＳ琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变ＨＥ琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色ＸＬＤ琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定５．４ 生化试验５．４．１ 自选择性琼脂平板上分别挑取２个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，必要时可延长至４８ｈ。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表２。犌犅４７８９．４—２０１６４ 表２ 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断ＫＡ＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属ＫＡ＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属ＡＡ＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属ＡＡ＋／－＋／－－非沙门氏菌ＫＫ＋／－＋／－＋／－非沙门氏菌 注：Ｋ：产碱，Ａ：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋／－：阳性或阴性。５．４．２ 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（ｐＨ７．２）、氰化钾（ＫＣＮ）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，必要时可延长至４８ｈ，按表３判定结果。将已挑菌落的平板储存于２℃～５℃或室温至少保留２４ｈ，以备必要时复查。表３ 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（Ｈ２Ｓ）靛基质ｐＨ７．２尿素氰化钾（ＫＣＮ）赖氨酸脱羧酶Ａ１＋－－－＋Ａ２＋＋－－＋Ａ３－－－－＋／－ 注：＋阳性；－阴性；＋／－阳性或阴性。５．４．２．１ 反应序号Ａ１：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、ＫＣＮ和赖氨酸脱羧酶３项中有１项异常，按表４可判定为沙门氏菌。如有２项异常为非沙门氏菌。表４ 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表ｐＨ７．２尿素氰化钾（ＫＣＮ）赖氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；－表示阴性。５．４．２．２ 反应序号Ａ２：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。５．４．２．３ 反应序号Ａ３：补做ＯＮＰＧ。ＯＮＰＧ阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。５．４．２．４ 必要时按表５进行沙门氏菌生化群的鉴别。犌犅４７８９．４—２０１６５ 表５ 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇＋＋——＋—山梨醇＋＋＋＋＋—水杨苷———＋——ＯＮＰＧ——＋—＋—丙二酸盐—＋＋———ＫＣＮ———＋＋— 注：＋表示阳性；—表示阴性。５．４．３ 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据５．４．１的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。５．５ 血清学鉴定５．５．１ 检查培养物有无自凝性一般采用１．２％～１．５％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应，在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动３０ｓ～６０ｓ，在黑色背景下观察反应（必要时用放大镜观察），若出现可见的菌体凝集，即认为有自凝性，反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。５．５．２ 多价菌体抗原（犗）鉴定在玻片上划出２个约１ｃｍ×２ｃｍ的区域，挑取１环待测菌，各放１／２环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加１滴多价菌体（Ｏ）抗血清，在另一区域下部加入１滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合１ｍｉｎ，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。Ｏ血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如２％～３％）培养基上再检查；如果是由于Ｖｉ抗原的存在而阻止了Ｏ凝集反应时，可挑取菌苔于１ｍＬ生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。５．５．３ 多价鞭毛抗原（犎）鉴定操作同５．５．２。Ｈ抗原发育不良时，将菌株接种在０．５５％～０．６５％半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过接种装有０．３％～０．４％半固体琼脂的小玻管１次～２次，自远端取菌培养后再检查。５．６ 血清学分型（选做项目）５．６．１ 犗抗原的鉴定用Ａ～Ｆ多价Ｏ血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。被Ａ～Ｆ多价Ｏ血清凝集者，依次用Ｏ４；Ｏ３、Ｏ１０；Ｏ７；Ｏ８；Ｏ９；Ｏ２和Ｏ１１因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定Ｏ群。被Ｏ３、Ｏ１０血清凝集的菌株，再用Ｏ１０、Ｏ１５、Ｏ３４、Ｏ１９单因子血清做凝集犌犅４７８９．４—２０１６６ 试验，判定Ｅ１、Ｅ４各亚群，每一个Ｏ抗原成分的最后确定均应根据Ｏ单因子血清的检查结果，没有Ｏ单因子血清的要用两个Ｏ复合因子血清进行核对。不被Ａ～Ｆ多价Ｏ血清凝集者，先用９种多价Ｏ血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的Ｏ群血清逐一检查，以确定Ｏ群。每种多价Ｏ血清所包括的Ｏ因子如下：Ｏ多价１ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ群（并包括６，１４群）Ｏ多价２ １３，１６，１７，１８，２１群Ｏ多价３ ２８，３０，３５，３８，３９群Ｏ多价４ ４０，４１，４２，４３群Ｏ多价５ ４４，４５，４７，４８群Ｏ多价６ ５０，５１，５２，５３群Ｏ多价７ ５５，５６，５７，５８群Ｏ多价８ ５９，６０，６１，６２群Ｏ多价９ ６３，６５，６６，６７群５．６．２ 犎抗原的鉴定属于Ａ～Ｆ各Ｏ群的常见菌型，依次用表６所述Ｈ因子血清检查第１相和第２相的Ｈ抗原。表６ 犃～犉群常见菌型 犎抗原表Ｏ群第１相第２相ＡＢＢＣ１Ｃ２Ｄ（不产气的）Ｄ（产气的）Ｅ１Ｅ４Ｅ４ａｇ，ｆ，ｓｉ，ｂ，ｄｋ，ｖ，ｒ，ｃｂ，ｄ，ｒｄｇ，ｍ，ｐ，ｑｈ，ｖｇ，ｓ，ｔｉ无无２５，ｚ１５２，５无无６，ｗ，ｘ无 不常见的菌型，先用８种多价Ｈ血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种Ｈ因子血清逐一检查，以第１相和第２项的Ｈ抗原。８种多价Ｈ血清所包括的Ｈ因子如下：Ｈ多价１ ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｉＨ多价２ ｅｈ，ｅｎｘ，ｅｎｚ１５，ｆｇ，ｇｍｓ，ｇｐｕ，ｇｐ，ｇｑ，ｍｔ，ｇｚ５１Ｈ多价３ ｋ，ｒ，ｙ，ｚ，ｚ１０，ｌｖ，ｌｗ，ｌｚ１３，ｌｚ２８，ｌｚ４０Ｈ多价４ １，２；１，５；１，６；１，７；ｚ６Ｈ多价５ ｚ４ｚ２３，ｚ４ｚ２４，ｚ４ｚ３２，ｚ２９，ｚ３５，ｚ３６，ｚ３８Ｈ多价６ ｚ３９，ｚ４１，ｚ４２，ｚ４４Ｈ多价７ ｚ５２，ｚ５３，ｚ５４，ｚ５５Ｈ多价８ ｚ５６，ｚ５７，ｚ６０，ｚ６１，ｚ６２每一个Ｈ抗原成分的最后确定均应根据Ｈ单因子血清的检查结果，没有Ｈ单因子血清的要用两个Ｈ复合因子血清进行核对。检出第１相Ｈ抗原而未检出第２相Ｈ抗原的或检出第２相Ｈ抗原而未检出第１相Ｈ抗原的，可犌犅４７８９．４—２０１６７ 在琼脂斜面上移种１代～２代后再检查。如仍只检出一个相的Ｈ抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：简易平板法：将０．３５％～０．４％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清１环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。小玻管法：将半固体管（每管约１ｍ