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中华人民共和国国家标准GB4789.8—2016食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB4789.8—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T4789.8—2008《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》。本标准与GB/T4789.8—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验”;———修改了典型菌落的形态描述;———删除了生化鉴定中的商品化名称;———描述了血清鉴定的方法。GB4789.8—20161食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的检验方法。本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:0℃~4℃。2.2恒温培养箱:26℃±1℃、36℃±1℃。2.3显微镜:10倍~100倍。2.4均质器。2.5天平:感量0.1g。2.6灭菌试管:16mm×160mm、15mm×100mm。2.7灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。2.8锥形瓶:200mL、500mL。2.9灭菌平皿:直径90mm。2.10微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1改良磷酸盐缓冲液:见A.1。3.2CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar):见A.2。3.3改良Y培养基(AgarY,Modified):见A.3。3.4改良克氏双糖培养基:见A.4。3.5糖发酵管:见A.5。3.6鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见A.6。3.7半固体琼脂:见A.7。3.8缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见A.8。3.9碱处理液:见A.9。3.10尿素培养基:见A.10。3.11营养琼脂:见A.11。3.12小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。GB4789.8—201624检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内,以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。均质后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。5.2碱处理除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。GB4789.8—201635.3分离将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板,26℃±1℃培养48h±2h。典型菌落在CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛眼状菌落),菌落大小为1mm~2mm,在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。5.4改良克氏双糖试验分别挑取5.3中的可疑菌落3个~5个,分别接种于改良克氏双糖铁琼脂,接种时先在斜面划线,再于底层穿刺,26℃±1℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。5.5尿素酶试验和动力观察用接种环挑取一满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应足够大,振摇几秒钟,26℃±1℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26℃±1℃和36℃±1℃培养24h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行纯化培养,用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。5.6革兰氏染色镜检将纯化的可疑菌进行革兰染色。小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8μm~3.0μm)×0.8μm5.7生化鉴定5.7.1从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26℃±1℃进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特征以及与其他相似菌的区别见表1。表1小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表项目小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica中间型耶尔森氏菌Yersiniaintermedia弗氏耶尔森氏菌Yersiniafrederiksenii克氏耶尔森氏菌Yersiniakirstensenii假结核耶尔森氏菌Yersiniapseudotuberculosis鼠疫耶尔森氏菌Yersiniapestis动力(26℃)+++++-尿素酶+++++-V-P试验(26℃)+++---鸟氨酸脱羧酶++++--蔗糖d++---棉子糖-+---d山梨醇++++--甘露醇++++++鼠李糖-++--+注:+阳性;-阴性;d有不同生化型。5.7.2如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养琼脂平板上挑取单菌落,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生GB4789.8—20164物生化鉴定系统进行鉴定。5.8血清型鉴定(选做项目)除进行生化鉴定外,可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴O因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5min~1min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无自凝现象;具体操作方法可按GB4789.4中沙门氏菌O因子血清分型方法进行。6结果与报告综合以上及生化特征报告结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。GB4789.8—20165附录A培养基和试剂A.1改良磷酸盐缓冲液A.1.1成分磷酸氢二钠8.23g磷酸二氢钠1.2g氯化钠5.0g三号胆盐1.5g山梨醇20.0gA.1.2制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中,再加入三号胆盐及山梨醇,溶解后校正pH至7.6,分装试管,于121℃高压灭菌15min,备用。A.2CIN-1培养基A.2.1基础培养基:胰胨20.0g酵母浸膏2.0g甘露醇20.0g氯化钠1.0g去氧胆酸钠2.0g硫酸镁0.01g琼脂12.0g蒸馏水950mL校正pH至7.5±0.1,将基础培养基于121℃高压灭菌15min,备用。A.2.2Irgasan(二氯苯氧氯酚):可用95%的乙醇作溶剂,溶解二苯醚,配成0.4%的溶液来替代Irgasan,待基础培养基冷至80℃时,加入1mL混匀。A.2.3冷至50℃时,加入:中性红(3.0mg/mL)10.0mL结晶紫(0.1mg/mL)10.0mL头孢菌素(1.5mg/mL)10.0mL新生霉素(0.25mg/mL)10.0mL最后不断搅拌加入10.0mL的10%氯化锶,倾注平皿。GB4789.8—20166A.3改良Y培养基A.3.1成分蛋白胨15.0g氯化钠5.0g乳糖10.0g草酸钠2.0g去氧胆酸钠6.0g三号胆盐5.0g丙酮酸钠2.0g孟加拉红40.0mg水解酪蛋白5.0g琼脂17.0g蒸馏水1000mLA.3.2制法将A.3.1中成分混合,校正pH至7.4±0.1。于121℃高压灭菌15min,待冷至45℃左右时,倾注平皿。A.4改良克氏双糖培养基A.4.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏3.0g酵母膏3.0g山梨醇20.0g葡萄糖1.0g氯化钠5.0g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂12.0g酚红0.025g蒸馏水1000mLA.4.2制法将酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH至7.4。加入0.2%的酚红溶液12.5mL,摇匀,分装试管,装量宜多些,以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。A.5糖发酵管A.5.1成分牛肉膏5.0gGB4789.8—20167蛋白胨10.0g氯化钠3.0g磷酸氢二钠2.0g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL蒸馏水1000mLA.5.2制法A.5.2.1葡萄糖发酵管按A.5.1中成分配好后,校正pH至7.4,按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。A.5.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。A.5.3试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于26℃±1℃培养,一般观察2d~3d。迟缓反应需观察14d~30d。A.6鸟氨酸脱羧酶试验培养基A.6.1成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水1000mL1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mLL-鸟氨酸或DL-鸟氨酸0.5g/100mL或1g/100mLA.6.2制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后,分装,每瓶100mL,分别加入鸟氨酸。L-鸟氨酸按0.5%加入,DL-鸟氨酸按1%加入。再校正pH至6.8。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。A.6.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种,于26℃±1℃培养18h~24h,观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。A.7半固体琼脂A.7.1成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化钠0.5gGB4789.8—20168琼脂0.35g~0.4g蒸馏水100mLA.7.2制法将A.7.1中成分配好,煮沸使溶解,并校正pH至7.4。分装小试管,121℃高压灭菌15min,直立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。A.8缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]A.8.1成分磷酸氢二钾5.0g多胨7.0g葡萄糖5.0g蒸馏水1000mLA.8.2制法溶化后校正pH至7.0,分装试管,每管1mL,121℃高压灭菌15min。A.8.3甲基红(MR)试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中,于26℃±1℃培养2d~5d,哈夫尼亚菌则应在22℃~25℃培养。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。甲基红试剂配法:10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。A.8.4V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中,于26℃±1℃培养2d~4d。哈夫尼亚菌则应在22℃~25℃培养。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36℃±1℃培养4h再进行观察。A.9碱处理液A.9.10.5%氯化钠溶液氯化钠0.5g蒸馏水100mL121℃高压灭菌15min。A.9.20.5%氢氧化钾溶液氢氧化钾0.5g蒸馏水100mL121℃高压灭菌15min。GB4789.8—20169A.9.3制法将0.5%氯化钠及0.5%氢氧化钾等量混合。A.10尿素培养基A.10.1成分尿素20.0g酵母浸膏0.1g磷酸二氢钾0.091g磷酸氢二钠0.095g酚红0.01g蒸馏水1000mLA.10.2制法将A.10.1中成分于蒸馏水中溶解,校正pH至6.8±0.2。不要加热,过滤除菌,无菌分装于灭菌小试管中,每管约为3mL。A.10.3试验方法挑取琼脂培养物接种在尿素培养基,26℃±1℃培养24h。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。A.11营养琼脂A.11.1成分蛋白胨10.0g牛肉浸膏3g氯化钠5g琼脂15g蒸馏水1000mLA.11.2制法将A.11.1中成分于蒸馏水中溶解,校正pH至7.3±0.2。121℃高压灭菌15min。