GB 4789.11-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.11-2014食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验2014-12-01发布2015-05-01实施GB4789.11—2014I前言本标准代替GB/T4789.11－2003《食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》。本标准与GB/T4789.11－2003相比，主要变化如下：——修改了标准名称；——修改了范围；——增加了术语和定义；——修改了设备与材料；——修改了培养基与试剂；——删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤和杆菌肽敏感试验；——增加了触酶试验；——增加了附录A。GB4789.11—20141食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验1范围本标准规定了食品中β型溶血性链球菌（Streptococcus）的检验方法。本标准适用于食品中β型溶血性链球菌的检验。2术语和定义2.1β型溶血在菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。2.2β型溶血性链球菌能够产生β型溶血的化脓（或A群）链球菌（Streptococcuspyogenes）和无乳（或B群）链球菌（Streptococcusagalactiae）。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃；c)厌氧培养装置；d)天平：感量0.1g；e)均质器与配套均质袋；f)显微镜：10倍～100倍；g)无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h)无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL；i)无菌培养皿：直径90mm；j)pH计或pH比色管或精密pH试纸；k)水浴装置：36℃±1℃；l)微生物生化鉴定系统。4培养基和试剂4.1改良胰蛋白胨大豆肉汤（Modifiedtryptonesoybeanbroth,mTSB）：见附录A中A.1。4.2哥伦比亚CNA血琼脂(ColumbiaCNAbloodagar)：见附录A中A.2。4.3哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar)：见附录A中A.3。4.4革兰氏染色液：见附录A中A.4。4.5胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptonesoybeanbroth,TSB）：见附录A中A.5。4.6草酸钾血浆：见附录A中A.6。GB4789.11—201424.70.25％氯化钙(CaCl2)溶液：见附录A中A.7。4.83％过氧化氢(H2O2)溶液：见附录A中A.8。4.9生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。5检验程序溶血性链球菌检验程序见图1。图1溶血性链球菌检验程序6操作步骤6.1样品处理及增菌按无菌操作称取检样25g（mL），加入盛有225mLmTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min；或加入盛有225mLmTSB的均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min。若样品为液态，振荡均匀即可。36℃±1℃培养18h～24h。6.2分离将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm～3mm，灰白色、半透18h~24h样品25g（或mL）+225mLmTSB划线接种哥伦比亚CNA血琼脂平板革兰氏染色镜检/触酶试验确定鉴定生化鉴定链激酶试验(选做项目)报告挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB36℃±1℃18h～24h，厌氧培养36℃±1℃18h～24h36℃±1℃GB4789.11—20143明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。6.3鉴定6.3.1分纯培养挑取5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培养18h～24h。6.3.2革兰氏染色镜检挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。6.3.3触酶试验挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性。6.3.4链激酶试验（选做项目）吸取草酸钾血浆0.2mL于0.8mL灭菌生理盐水中混匀，再加入经36℃±1℃培养18h～24h的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动）。继续36℃±1℃培养24h，凝固块重新完全溶解为阳性，不溶解为阴性，β型溶血性链球菌为阳性。6.3.5其他检验使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。7结果与报告综合以上试验结果，报告每25g（mL）检样中检出或未检出溶血性链球菌。GB4789.11—20144附录A培养基与试剂A.1改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Modifiedtryptonesoybeanbroth,mTSB）A.1.1基础培养基（胰蛋白胨大豆肉汤TSB）A.1.1.1成分胰蛋白胨17.0g大豆蛋白胨3.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾（无水）2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000.0mLA.1.1.2制法将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌15min，备用。A.1.2抗生素溶液A.1.2.1多黏菌素溶液称取10mg多黏菌素B于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。A.1.2.2萘啶酮酸钠溶液称取10mg萘啶酮酸于10mL0.05mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。A.1.3完全培养基A.1.3.1成分胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)1000.0mL多黏菌素溶液10.0mL萘啶酮酸钠溶液10.0mLA.1.3.2制法无菌条件下，将A.1.3.1中各成分进行混合，充分混匀，分装备用。A.2哥伦比亚CNA血琼脂(ColumbiaCNAbloodagar)A.2.1成分胰酪蛋白胨12.0g动物组织蛋白消化液5.0g酵母提取物3.0g牛肉提取物3.0gGB4789.11—20145玉米淀粉1.0g氯化钠5.0g琼脂13.5g多黏菌素0.01g萘啶酸0.01g蒸馏水1000.0mLA.2.2制法将A.2.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.30.2，121℃灭菌12min，待冷却至50℃左右时加50mL；无菌脱纤维绵羊血，摇匀后倒平板。A.3哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar)A.3.1基础培养基A.3.1.1成分动物组织酶解物23.0g淀粉1.0g氯化钠5.0g琼脂8.0g～18.0g蒸馏水1000.0mLA.3.1.2制法将基础培养基成分溶解于蒸馏水中，加热促其溶解。121℃高压灭菌15min。A.3.2无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A.3.3完全培养基A.3.3.1组分基础培养基1000.0mL无菌脱纤维绵羊血50.0mLA.3.3.2制法当基础培养基的温度为45℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。校正pH至7.2±0.2。倾注15mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h，或在4℃冷藏不得超过7d。A.4革兰氏染色液A.4.1结晶紫染色液基础培养基A.4.1.1成分GB4789.11—20146结晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mLA.4.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.4.2革兰氏碘液A.4.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.4.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.4.3沙黄复染液A.4.3.1成分沙黄0.25g95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.4.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.4.4染色操作步骤将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加复染液，复染1min，水洗后进行干燥，镜检。A.5胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptonesoybeanbroth,TSB）A.5.1成分胰蛋白胨17.0g大豆蛋白胨3.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾（无水）2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000.0mLA.5.2制法将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌15min，分装备用。GB4789.11—20147A.6草酸钾血浆A.6.1成分草酸钾0.01g人血5.0mLA.6.2制法草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾血浆。A.70.25％氯化钙(CaCl2)溶液A.7.1成分氯化钙（无水）22.2g蒸馏水1000.0mLA.7.2制法称取22.2g氯化钙（无水）溶于蒸馏水中，分装备用。A.83％过氧化氢(H2O2)溶液A.8.1成分30％过氧化氢(H2O2)溶液100.0mL蒸馏水900.0mLA.8.2制法吸取100mL30％过氧化氢(H2O2)溶液，溶于蒸馏水中，混匀，分装备用。