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中华人民共和国国家标准GB4789.28—2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求2013-11-29发布2014-06-01实施GB4789.28—20131前言本标准代替GB/T4789.28－2003《食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》。本标准与GB/T4789.28－2003相比，主要修改如下：——删除了培养基和试剂的配方和配制方法。——增加了培养基和试剂的质量控制方法和指标。GB4789.28—20132食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求1范围本标准规定了食品微生物学检验用培养基和试剂的质量要求。本标准适用于食品微生物学检验用培养基和试剂的质量控制。2术语和定义2.1质量控制为满足质量要求所采取的技术操作和活动。2.2培养基或试剂的批量培养基或试剂完整的可追溯单位，是指满足产品要求（内部控制）和性能测试，产品型号和质量稳定的一定量的半成品或成品。这些产品在特定的生产周期生产，而且编号相同。2.3培养基及试剂的性能在特定条件下培养基对测试菌株的反应。2.4培养基液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂)、鉴定或保持其活力的物质。2.5纯化学培养基由已知分子结构和纯度的化学成分配制而成的培养基。2.6未定义和部分定义的化学培养基全部或部分由天然物质、加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。2.7固体培养基在液体培养基中加入一定量固化物（如：琼脂、明胶等），加热至100℃溶解，冷却后凝固成固体状态的培养基。倾注到平皿内的固体培养基一般称之为“平板”；倒入试管并摆放成斜面的固体培养基，当培养基凝固后通常称作“斜面”。2.8半固体培养基在液体培养基中加入极少量固化物（如：琼脂、明胶等），加热至100℃溶解，冷却后凝固成半固体状态的培养基。GB4789.28—201332.9运输培养基在取样后和实验室处理前保护和维持微生物活性且不允许明显增殖的培养基。运输培养基中通常不允许包含使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌株(如：缓冲甘油-氯化钠溶液运输培养基)。2.10保藏培养基用于在一定期限内保护和维持微生物活力，防止长期保存对其的不利影响，或使其在长期保存后容易复苏的培养基(如：营养琼脂斜面)。2.11悬浮培养基将测试样本的微生物分散到液相中，在整个接触过程中不产生增殖或抑制作用(如：磷酸盐缓冲液)。2.12复苏培养基能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基。2.13增菌培养基通常为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供特定的生长环境。2.14选择性增菌培养基能够允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生长的培养基（如：TTB培养基）。2.15非选择性增菌培养基能够保证多种微生物生长的培养基（如：营养肉汤）。2.16分离培养基支持微生物生长的固体或半固体培养基。2.17选择性分离培养基支持特定微生物生长而抑制其他微生物生长的分离培养基（如：XLD琼脂）。2.18非选择性分离培养基对微生物没有选择性抑制的分离培养基（如：营养琼脂）。2.19鉴别培养基(特异性培养基)能够进行一项或多项微生物生理和（或）生化特性鉴定的培养基（如：麦康凯琼脂）。注：能够用于分离培养的鉴别培养基被称作分离（鉴别）培养基(如：XLD琼脂)。2.20鉴定培养基能够产生一个特定的鉴定反应而通常不需要进一步确证实验的培养基(如：乳糖发酵管)。注：用于分离的鉴定培养基被称为分离（鉴定）培养基。GB4789.28—201342.21计数培养基能够对微生物定量的选择性（如：MYP琼脂）或非选择性培养基（如：平板计数琼脂）。注：计数培养基可包含复苏和(或)增菌培养基的特性。2.22确证培养基在初步复苏、分离和(或)增菌阶段后对微生物进行部分或完全鉴定或鉴别的培养基(如：BGLB肉汤)。2.23商品化即用型培养基以即用形式或融化后即用形式置于容器（例如平皿、试管或其他容器）内供应的液体、固体或半固体培养基：——完全可即用的培养基；——需重新融化的培养基(如用于平板倾注技术)；——使用前需重新融化并分装（如倾注到平皿）的培养基；——使用前需重新融化，添加物质并分装的培养基(如：TSC培养基和BairdParker琼脂)。2.24商品化脱水合成培养基使用前需加水和进行处理的干燥培养基，如：粉末、小颗粒、冻干等形式：——完全培养基；——不完全培养基，使用的时候需加入添加剂。2.25自制培养基依据完整配方的具体成份配制的培养基。2.26试剂用于食品微生物检验的染色剂和培养基配套试剂。2.27测试菌株通常用于培养基性能测试的微生物。注：测试菌株根据其来源不同(见2.29-2.32)可进行进一步定义。2.28标准菌株直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株。按菌株特性进行分类和描述，最好来源于食品或水的菌株。2.29标准储备菌株将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。2.30储备菌株从标准储备菌株转接一代获得的培养物。2.31工作菌株由标准储备菌株、储备菌株或标准物质（经证明或未经证明）转接一代获得的菌株。GB4789.28—20135注：标准物质是指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种，经证明的标准物是指其浓度已经证明。3培养基及试剂质量保证3.1证明文件3.1.1生产企业提供的文件生产企业应提供以下资料(可提供电子文本)：——培养基或试剂的各种成分、添加成分名称及产品编号；——批号；——最终pH(适用于培养基)；——储存信息和有效期；——标准要求及质控报告；——必要的安全和（或）危害数据。3.1.2产品的交货验收对每批产品，应记录接收日期，并检查：——产品合格证明；——包装的完整性；——产品的有效期；——文件的提供。3.2贮存3.2.1一般要求应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行培养基和试剂的保存和使用。3.2.2脱水合成培养基及其添加成分的质量管理和质量控制脱水合成培养基一般为粉状或颗粒状形式包装于密闭的容器中。用于微生物选择或鉴定的添加成分通常为冻干物或液体。培养基的购买应有计划，以利于存货的周转（即掌握先购先用的原则）。实验室应保存有效的培养基目录清单，清单应包括以下内容：——容器密闭性检查；——记录首次开封日期；——内容物的感官检查。开封后的脱水合成培养基，其质量取决于贮存条件。通过观察粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断脱水培养基的质量的变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。3.2.3商品化即用型培养基和试剂应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行保存和使用。3.2.4实验室自制的培养基GB4789.28—20136在保证其成分不会改变条件下保存，即避光、干燥保存，必要时在5℃±3℃冰箱中保存，通常建议平板不超过2周～4周，瓶装及试管装培养基不超过3个月～6个月，除非某些标准或实验结果表明保质期比上述的更长。建议需在培养基中添加的不稳定的添加剂应即配即用，除非某些标准或实验结果表明保质期更长；含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。培养基的贮存应建立经验证的有效期。观察培养基是否有颜色变化、蒸发（脱水）或微生物生长的情况，当培养基发生这类变化时，应禁止使用。培养基使用或再次加热前，应先取出平衡至室温。3.3培养基的实验室制备3.3.1一般要求正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一，使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题（见附录A）。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制。如重量（体积）、pH、制备日期、灭菌条件和操作步骤等。实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息，如：培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积（分装体积）、无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）、配置日期、人员等，以便溯源。3.3.2水实验用水的电导率在25℃时不应超过25μS/cm(相当于电阻率≥0.4ΜΩcm)，除非另有规定要求。水的微生物污染不应超过103CFU/mL。应按GB4789.2，采用平板计数琼脂培养基，在36℃±1℃培养48h±2h进行定期检查微生物污染。3.3.3称重和溶解小心称量所需量的脱水合成培养基（必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入适量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后加水至所需的量后适当加热，并重复或连续搅拌使其快速分散，必要时应完全溶解。含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。3.3.4pH的测定和调整用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整，则使用灭菌或除菌的溶液。3.3.5分装将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。3.3.6灭菌3.3.6.1一般要求培养基应采用湿热灭菌法（3.3.6.2）或过滤除菌法（见3.3.6.3）。GB4789.28—20137某些培养基不能或不需要高压灭菌，可采用煮沸灭菌，如SC肉汤等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，煮沸后应迅速冷却，避光保存；有些试剂则不需灭菌，可直接使用（参见相关标准或供应商使用说明）。3.3.6.2湿热灭菌湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行，高压灭菌一般采用121℃±3℃灭菌15min，具体培养基按食品微生物学检验标准中的规定进行灭菌。培养基体积不应超过1000mL，否则灭菌时可能会造成过度加热。所有的操作应按照标准或使用说明的规定进行。灭菌效果的控制是关键问题。加热后采用适当的方式冷却，以防加热过度。这对于大容量和敏感培养基十分重要，例如含有煌绿的培养基。3.3.6.3过滤除菌过滤除菌可在真空或加压的条件下进行。使用孔径为0.2μm的无菌设备和滤膜。消毒过滤设备的各个部分或使用预先消毒的设备。一些滤膜上附着有蛋白质或其他物质（如抗生素），为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。3.3.6.4检查应对经湿热灭菌或过滤除菌的培养基进行检查，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行检查。3.3.7添加成分的制备制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时应小心操作（必要时在通风柜中操作），避免因粉尘的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应；制备溶液时应按产品使用说明操作。不要使用过期的添加剂；抗生素工作溶液应现用现配；批量配制的抗生素溶液可分装后冷冻贮存，但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。3.4培养基的使用3.4.1琼脂培养基的融化将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的层流蒸汽）使之融化。经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2min）以避免玻璃瓶破碎。融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度)，直至使用，培养基达到47℃～50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。倾注到样品中的培养基温度应控制在约45℃左右。3.4.2培养基的脱氧必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min；加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度（如FT培养基）。3.4.3添加成分的加入GB4789.28—20138对热不稳定的添加成分应在培养基