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中华人民共和国国家标准GB4789.30—2016食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.30—2016Ⅰ前言本标准代替GB4789.30—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。本标准与GB4789.30—2010相比,主要变化如下:———增加了“第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法”;———增加了“第三法单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法”;———修改了范围。GB4789.30—20161食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2℃~5℃。2.2恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃。2.3均质器。2.4显微镜:10x~100x。2.5电子天平:感量0.1g。2.6锥形瓶:100mL、500mL。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌平皿:直径90mm。2.9无菌试管:16mm×160mm。2.10离心管:30mm×100mm。2.11无菌注射器:1mL。2.12单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。2.13英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。2.14伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。2.15斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。2.16金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株。2.17马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。2.18小白鼠:ICR体重18g~22g。2.19全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见A.1。GB4789.30—201623.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见A.2。3.3李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):见A.3。3.41%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:见A.3.2.1、A.3.2.2。3.51%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:见A.3.2.1、A.3.2.2。3.6PALCAM琼脂:见A.4。3.7革兰氏染液:见A.5。3.8SIM动力培养基:见A.6。3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见A.7。3.105%~8%羊血琼脂:见A.8。3.11糖发酵管:见A.9。3.12过氧化氢试剂:见A.10。3.13李斯特氏菌显色培养基。3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。3.15缓冲蛋白胨水:见A.11。第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验4检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序GB4789.30—201635操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g(mL)加入到含有225mLLB1增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min~2min;或放入盛有225mLLB1增菌液的均质杯中,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min。于30℃±1℃培养24h±2h,移取0.1mL,转种于10mLLB2增菌液内,于30℃±1℃培养24h±2h。5.2分离取LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板,于36℃±1℃培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定。5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃培养24h±2h,同时在TSA-YE平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h,然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。5.4鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)5.4.1染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。5.4.2动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM动力培养基,于25℃~30℃培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果。5.4.3生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。5.4.4溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36℃±1℃培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4℃冰箱24h~48h再观察。注:也可用划线接种法。5.4.5协同溶血试验cAMP(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36℃±1℃培养24h~48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显,可置4℃冰箱24h~48h再观察。注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象。GB4789.30—20164表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)++++/+-+-+格氏李斯特氏菌(L.grayi)-+++/++--+斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)++++/+--++威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)-+++/+-V++伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)++++/+--++英诺克李斯特氏菌(L.innocua)-+++/+-V-+注:+阳性;-阴性;V反应不定。5.5小鼠毒力试验(可选项目)将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中,于36℃±1℃培养24h,4000r/min离心5min,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010CFU/mL的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5mL,同时观察小鼠死亡情况。接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡。试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。5.6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法6检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2。GB4789.30—20165图2单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1以无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1min~2min或以8000r/min~10000r/min均质1min~2min。液体样品,振荡混匀,制成1∶10的样品匀液。7.1.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。7.1.3按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。7.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。7.3培养7.3.1在通常情况下,涂布后,将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36℃±1℃培养24h~48h。7.4典型菌落计数和确认7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU之间的平板,计数典型菌落数。如果:a)只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU~150CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)所有稀释度的平板菌落数均小于15CFU且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型GB4789.30—20166菌落;c)某一稀释度的平板菌落数大于150CFU且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d)所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e)所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CFU之间且有典型菌落,其中一部分小于15CFU或大于150CFU时,应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平板上的典型菌落。以上按式(1)计算。f)2个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU~150CFU之间,按式(2)计算。7.4.3从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3、5.4进行鉴定。8结果计数T=ABCd…………………………(1)式中:T———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A———某一稀释度典型菌落的总数;B———某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C———某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d———稀释因子。T=A1B1/C1+A2B2/C21.1d…………………………(2)式中:T———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A1———第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B1———第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C1———第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌