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书书书中华人民共和国国家标准犌犅４７８９．３４—２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验２０１６１２２３发布２０１７０６２３实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布书书书犌犅４７８９．３４—２０１６Ⅰ 前 言 本标准代替ＧＢ４７８９．３４—２０１２《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定》。本标准与ＧＢ４７８９．３４—２０１２相比，主要变化如下：———增加了双歧杆菌的计数方法；———增加了ＭＲＳ培养基；———修改了标准的适用范围；———修改了附录Ｂ为可选项。犌犅４７８９．３４—２０１６１ 食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验１ 范围本标准规定了双歧杆菌（犅犻犳犻犱狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿）的鉴定及计数方法。本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数，即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种。２ 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：２．１ 恒温培养箱：３６℃±１℃。２．２ 冰箱：２℃～５℃。２．３ 天平：感量０．０１ｇ。２．４ 无菌试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１００ｍｍ。２．５ 无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器（２００μＬ～１０００μＬ）及配套吸头。２．６ 无菌培养皿：直径９０ｍｍ。３ 培养基和试剂３．１ 双歧杆菌培养基：见Ａ．１。３．２ ＰＹＧ培养基：见Ａ．２。３．３ ＭＲＳ培养基：见Ａ．３。３．４ 甲醇：分析纯。３．５ 三氯甲烷：分析纯。３．６ 硫酸：分析纯。３．７ 冰乙酸：分析纯。３．８ 乳酸：分析纯。４ 检验程序双歧杆菌的检验程序见图１。犌犅４７８９．３４—２０１６２ 图１ 双歧杆菌的检验程序５ 操作步骤５．１ 无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序。犌犅４７８９．３４—２０１６３ ５．２ 双歧杆菌的鉴定５．２．１ 纯菌菌种５．２．１．１ 样品处理：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或ＭＲＳ琼脂平板。固体菌种或真空冷冻干燥菌种，可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液，溶解菌粉。５．２．１．２ 接种：接种于双歧杆菌琼脂平板或ＭＲＳ琼脂平板。３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ±２ｈ，可延长至７２ｈ±２ｈ。５．２．２ 食品样品５．２．２．１ 样品处理：取样２５．０ｇ（ｍＬ），置于装有２２５．０ｍＬ生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内，于８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。冷冻样品可先使其在２℃～５℃条件下解冻，时间不超过１８ｈ；也可在温度不超过４５℃的条件解冻，时间不超过１５ｍｉｎ。５．２．２．２ 接种或涂布：将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或ＭＲＳ琼脂平板，或取０．１ｍＬ适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或ＭＲＳ琼脂平板。３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ±２ｈ，可延长至７２ｈ±２ｈ。５．２．２．３ 纯培养：挑取３个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或ＭＲＳ琼脂平板。３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ±２ｈ，可延长至７２ｈ±２ｈ。５．２．３ 菌种鉴定５．２．３．１ 涂片镜检：挑取双歧杆菌平板或ＭＲＳ平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌为革兰氏染色阳性，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉等多形态，不抗酸，无芽孢，无动力。５．２．３．２ 生化鉴定：挑取双歧杆菌平板或ＭＲＳ平板上生长的双歧杆菌单个菌落，进行生化反应检测。过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表１。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表１ 双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌（犅．犫犻犳犻犱狌犿）婴儿双歧杆菌（犅．犻狀犳犪狀狋犻狊）长双歧杆菌（犅．犾狅狀犵狌犿）青春双歧杆菌（犅．犪犱狅犾犲狊犮犲狀狋犻狊）动物双歧杆菌（犅．犪狀犻犿犪犾犻狊）短双歧杆菌（犅．犫狉犲狏犲）１Ｌ－阿拉伯糖－－＋＋＋－２Ｄ核糖－＋＋＋＋＋３Ｄ木糖－＋＋ｄ＋＋４Ｌ木糖－－－－－－５阿东醇－－－－－－６Ｄ半乳糖ｄ＋＋＋ｄ＋７Ｄ葡萄糖＋＋＋＋＋＋８Ｄ果糖ｄ＋＋ｄｄ＋９Ｄ甘露糖－＋＋－－－１０Ｌ山梨糖－－－－－－犌犅４７８９．３４—２０１６４ 表１（续）编号项目两歧双歧杆菌（犅．犫犻犳犻犱狌犿）婴儿双歧杆菌（犅．犻狀犳犪狀狋犻狊）长双歧杆菌（犅．犾狅狀犵狌犿）青春双歧杆菌（犅．犪犱狅犾犲狊犮犲狀狋犻狊）动物双歧杆菌（犅．犪狀犻犿犪犾犻狊）短双歧杆菌（犅．犫狉犲狏犲）１１Ｌ鼠李糖－－－－－－１２卫矛醇－－－－－－１３肌醇－－－－－＋１４甘露醇－－－－ａ－－ａ１５山梨醇－－－－ａ－－ａ１６α甲基Ｄ葡萄糖甙－－＋－－－１７犖乙酰葡萄糖胺－－－－－＋１８苦杏仁甙（扁桃甙）－－－＋＋－１９七叶灵－－＋＋＋－２０水杨甙（柳醇）－＋－＋＋－２１Ｄ纤维二糖－＋－ｄ－－２２Ｄ麦芽糖－＋＋＋＋＋２３Ｄ乳糖＋＋＋＋＋＋２４Ｄ蜜二糖－＋＋＋＋＋２５Ｄ蔗糖－＋＋＋＋＋２６Ｄ海藻糖（覃糖）－－－－－－２７菊糖（菊根粉）－－ａ－－ａ－－ａ２８Ｄ松三糖－－＋＋－－２９Ｄ棉籽糖－＋＋＋＋＋３０淀粉－－－＋－－３１肝糖（糖原）－－－－－－３２龙胆二糖－＋－＋＋＋３３葡萄糖酸钠－－－＋－－ 注：＋表示９０％以上菌株阳性；－表示９０％以上菌株阴性；ｄ表示１１％～８９％以上菌株阳性。 ａ表示某些菌株阳性。５．２．３．３ 有机酸测定：测定双歧杆菌的有机酸代谢产物（可选项），见附录Ｂ。５．３ 双歧杆菌的计数５．３．１ 纯菌菌种５．３．１．１ 固体和半固体样品的制备：以无菌操作称取２．０ｇ样品，置于盛有１９８．０ｍＬ稀释液的无菌均质杯内，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或置于盛有１９８．０ｍＬ稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１００的样品匀液。犌犅４７８９．３４—２０１６５ ５．３．１．２ 液体样品的制备：以无菌操作量取１．０ｍＬ样品，置于９．０ｍＬ稀释液中，混匀，制成１∶１０的样品匀液。５．３．２ 食品样品５．３．２．１ 样品处理：取样２５．０ｇ（ｍＬ），置于装有２２５．０ｍＬ生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内，于８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。冷冻样品可先使其在２℃～５℃条件下解冻，时间不超过１８ｈ；也可在温度不超过４５℃的条件解冻，时间不超过１５ｍｉｎ。５．３．３ 系列稀释及培养用１ｍＬ无菌吸管或微量移液器，制备１０倍系列稀释样品匀液，于８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ。每递增稀释一次，即换用１次１ｍＬ灭菌吸管或吸头。根据对样品浓度的估计，选择２个～３个适宜稀释度的样品匀液，在进行１０倍递增稀释时，吸取１．０ｍＬ样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取１．０ｍＬ空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将１５ｍＬ～２０ｍＬ冷却至４６℃的双歧杆菌琼脂培养基或ＭＲＳ琼脂培养基（可放置于４６℃±１℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释到平板倾注要求在１５ｍｉｎ内完成。待琼脂凝固后，将平板翻转，３６℃±１℃厌氧培养４８ｈ±２ｈ，可延长至７２ｈ±２ｈ。培养后计数平板上的所有菌落数。５．３．４ 菌落计数５．３．４．１ 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）表示。５．３．４．２ 选取菌落数在３０ＣＦＵ～３００ＣＦＵ之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于３０ＣＦＵ的平板记录具体菌落数，大于３００ＣＦＵ的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。５．３．４．３ 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以２，代表一个平板菌落数。５．３．４．４ 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。５．３．５ 结果的表述５．３．５．１ 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克或每毫升中菌落总数结果。５．３．５．２ 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（１）计算：犖＝犆（狀１＋０．１狀２）犱…………………………（１） 式中：犖———样品中菌落数；犆———平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；狀１———第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；狀２———第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；犱———稀释因子（第一稀释度）。５．３．５．３ 若所有稀释度的平板上菌落数均大于３００ＣＦＵ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可犌犅４７８９．３４—２０１６６ 记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。５．３．５．４ 若所有稀释度的平板菌落数均小于３０ＣＦＵ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。５．３．５．５ 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。５．３．５．６ 若所有稀释度的平板菌落数均不在３０ＣＦＵ～３００ＣＦＵ之间，其中一部分小于３０ＣＦＵ或大于３００ＣＦＵ时，则以最接近３０ＣＦＵ或３００ＣＦＵ的平均菌落数乘以稀释倍数计算。５．３．６ 菌落数的报告５．３．６．１ 菌落数小于１００ＣＦＵ时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。５．３．６．２ 菌落数大于或等于１００ＣＦＵ时，第３位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前２位数字，后面用０代替位数；也可用１０的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。５．３．６．３ 称重取样以ＣＦＵ／ｇ为单位报告，体积取样以ＣＦＵ／ｍＬ为单位报告。５．４ 结果与报告根据５．２．３．１、５．２．３．２、５．２．３．３结果，报告双歧杆菌属的种名。根据５．３．６菌落计数结果出具报告，报告单位以ＣＦＵ／ｇ（ｍＬ）表示。犌犅４７８９．３４—２０１６７ 附 录 犃培养基和试剂犃．１ 双歧杆菌琼脂培养基犃．１．１ 成分蛋白胨 １５．０ｇ酵母浸膏 ２．０ｇ葡萄糖 ２０．０ｇ可溶性淀粉 ０．５ｇ氯化钠 ５．０ｇ西红柿浸出液 ４００．０ｍＬ吐温８０ １．０ｍＬ肝粉 ０．３ｇ琼脂粉 ２０．０ｇ加蒸馏水至 １０００．０ｍＬ犃．１．２ 制法犃．１．２．１ 半胱氨酸盐溶液的配制：称取半胱氨酸０．５ｇ，加入１．０ｍＬ盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。犃．１．２．２ 西红柿浸出液的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在１００℃水浴中加热，搅拌９０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，校正ｐＨ７．０±０．１，将浸出液分装后，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。犃．１．２．３ 制法：将Ａ．１．１所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，然后加入半胱氨酸盐溶液，校正ｐＨ至６．８±０．１。分装后１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。犃．２ 犘犢犌液体培养基犃．２．１ 成分蛋白胨 １０．０ｇ葡萄糖 ２．５ｇ酵母粉 ５．０ｇ半胱氨酸ＨＣｌ ０．２５ｇ盐溶液 ２０．０ｍＬ维生素Ｋ１溶液 ０．５ｍＬ氯化血红素溶液５ｍｇ／ｍＬ ２．５ｍＬ加蒸馏水至 ５００．０ｍＬ犃．２．２ 制法犃．２．２．１ 盐溶液的配制：称取无水氯化钙０．２ｇ，硫酸镁０．２ｇ，磷酸氢二钾１．０ｇ，磷酸二氢钾１．０ｇ，碳酸犌犅４７８９．３４—２