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中华人民共和国国家标准GB4789.40—2010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination：Enterobactersakazakii中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施GB4789.40—2010I前言本标准代替GB/T4789.40-2008《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》。本标准与GB/T4789.40-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中英文名称；——删除了附录A中A.3。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB/T4789.40-2008。GB4789.40—20101食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验1范围本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3恒温水浴箱：44℃±0.5℃。2.4天平：感量0.1g。2.5均质器。2.6振荡器。2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。2.8无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。2.9无菌培养皿：直径90mm。2.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水（bufferpeptonewater，BPW）：见附录A中A.1。3.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm）：见附录A中A.2。3.3阪崎肠杆菌显色培养基。3.4胰蛋白胨大豆琼脂（trypticasesoyagar，TSA）：见附录A中A.3。3.5生化鉴定试剂盒。3.6氧化酶试剂：见附录A中A.4。3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.5。GB4789.40—201023.8L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.6。3.9L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A中A.7。3.10糖类发酵培养基：见附录A中A.8。3.11西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.9。GB4789.40—201031mL+mLST-Vm10mL挑取疑似菌落第一法阪崎肠杆菌的检验4检验程序阪崎肠杆菌检验程序见图1。图1阪崎肠杆菌检验程序5操作步骤5.1前增菌和增菌取检样100g（mL）加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。5.2分离5.2.1轻轻混刀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色36℃±1℃，18h±2h报告TSA生化鉴定挑取黄色菌落检样100g（mL）+BPW稀释液900mL44℃±0.5℃，24h±2h阪崎肠杆菌显色培养基36℃±1℃，24h±2h25℃±1℃，48h±4hGB4789.40—20104培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h。5.2.2挑取1个～5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。5.3鉴定自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1阪崎肠杆菌的主要生化特征生化试验特征黄色素产生＋氧化酶－L-赖氨酸脱羧酶－L-鸟氨酸脱羧酶（＋）L-精氨酸双水解酶＋柠檬酸水解（＋）D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋发酵苦杏仁甙＋注：＋＞99%阳性；－＞99%阴性；（＋）90%－99%阳性；（－）90%－99%阴性。6结果与报告综合菌落形态和生化特征，报告每100g（mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。第二法阪崎肠杆菌的计数7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：无菌称取样品100g、10g、1g各三份，加入已预热至44℃分别盛有900mL、90mL、9mLBPW中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10样品刀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.1.2液体样品：以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，加入已预热至44℃分别盛有900mL、90mL、9mLBPW中，轻轻振摇使充分混刀，制成1:10样品刀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.2分离、鉴定同5.2，5.3。8结果与报告GB4789.40—20105综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN值（见附录Ｂ中表B.1）。GB4789.40—20106附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLpH7.2A.1.2制法加热搅拌至溶解,调节pH，121℃高压灭菌15min。A.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm）A.2.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤A.2.1.1成分氯化钠34.0g胰蛋白胨20.0g乳糖5.0g磷酸二氢钾2.75g磷酸氢二钾2.75g十二烷基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.2.1.2制法加热搅拌至溶解，调节pH。分装每管10mL，121℃高压灭菌15min。A.2.2万古霉素溶液A.2.2.1成分万古霉素10.0mg蒸馏水10.0mLA.2.2.2制法10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃～5℃保存15天。A.2.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm）每10mLmLST加入万古霉素溶液0.1mL，混合液中万古霉素的终浓度为10µg/mL。注：mLST-Vm必须在24h之内使用。A.3胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）A.3.1成分GB4789.40—20107胰蛋白胨15.0g植物蛋白胨5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.3±0.2A.3.2制法加热搅拌至溶解，煮沸1min，调节pH，121℃高压15min。A.4氧化酶试剂A.4.1成分N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100mLA.4.2制法少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.4.3试验方法用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注：实验中切勿使用镍/铬材料。A.5L-赖氨酸脱羧酶培养基A.5.1成分L-赖氨酸盐酸盐（L-lysinemonohydrochloride）5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.5.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL，121℃高压15min。A.5.3实验方法挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.6L-鸟氨酸脱羧酶培养基A.6.1成分L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithinemonohydrochloride）5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.6.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL。121℃高压15min。GB4789.40—20108A.6.3实验方法挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.7L-精氨酸双水解酶培养基A.7.1成分L-精氨酸盐酸盐（L-argininemonohydrochloride）5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.015g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.7.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL。121℃高压15min。A.7.3实验方法挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.8糖类发酵培养基A.8.1基础培养基A.8.1.1成分酪蛋白（酶消化）10.0g氯化钠5.0g酚红0.02g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.8.1.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL。121℃高压15min。A.8.2糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）A.8.2.1成分糖8.0g蒸馏水100mLA.8.2.2制法分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，制成80mg/mL的糖类溶液。A.8.3完全培养基A.8.3.1成分基础培养基875mL糖类溶液125mLA.8.3.2制法无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混刀；分装到无菌试管中，每管10mL。A.8.4实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。GB4789.40—20109A.9西蒙氏柠檬酸盐培养基A.9.1成分柠檬酸钠2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢铵1.0g硫酸镁0.2g溴百里香酚蓝0.08g琼脂8.0g～18.0g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.9.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装10mL，121℃高压15min，制成斜面。A.9.3实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面，36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。GB4789.40—201010附录B（规范性附录）阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表B.1阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表每100g（mL）检样中阪崎肠杆菌昀可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表阳性管数95%可信限阳性管数95%可信限100101MPN下限上限100101MPN下限上限000＜0.3--0.952202.10.454.20010.30.0150.962212.80.879.40100.30.0151.12223.50.879.40110.610.121.82302.90.879.40200.620.121.82313.60.879.40300.940.363.83002.30.469.41000.360.0171.83013.80.87111010.720.131.83026.41.7181021.10.363.83104.30.9181100.740.1323117.51.7201111.10.363.8312123.7421201.10.364.2313164421211.50.454.23209.31.842