GB 4789.42-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验

中华人民共和国国家标准GB4789.42—2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.42—20161前言本标准代替SN/T1635—2005《贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》。本标准与SN/T1635—2005相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验”;———标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”;———修改“操作步骤”;———增加“质量控制要求”,可参见附录C;———删除“普通RT-PCR方法”。GB4789.42—20162食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光PCR仪。2.2冷冻离心机。2.3无菌刀片或等效均质器。2.4涡旋仪。2.5天平:感量为0.1g。2.6振荡器。2.7水浴锅。2.8离心机。2.9高压灭菌锅。2.10低温冰箱:-80℃。2.11微量移液器。2.12pH计或精密pH试纸。2.13网状过滤袋:400mL。2.14无菌棉拭子。2.15无菌贝类剥刀。2.16橡胶垫。2.17无菌剪刀。2.18无菌钳子。2.19无菌培养皿。2.20无RNase玻璃容器:见E.1.2。2.21无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。3.1GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。3.2过程控制病毒的引物、探针:见A.1。GB4789.42—201633.3过程控制病毒:制备见附录C。3.4外加扩增控制RNA:制备见附录D。3.5Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液:见E.2.2。3.65×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。3.7磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6。3.1075%乙醇:见E.2.7。3.11Trizol试剂:见E.2.8。4检验程序诺如病毒检验程序见图1。图1诺如病毒检验程序5操作步骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置2~3个平行处理。5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)。5.1.1.2将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGBE溶液(软质水果样品,GB4789.42—20164需加入30UA.niger果胶酶,或1140UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒。5.1.1.3室温,60次/min,振荡20min。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整一次pH,延长振荡时间10min。5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。10000r/min,4℃,离心30min。取上清至干净试管或三角瓶,用1mol/LHCl调pH至7.0。5.1.1.5加入0.25倍体积5×PEG/NaCl溶液,使终溶液浓度为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。60s摇匀,4℃,60次/min,振荡60min。10000r/min,4℃,离心30min,弃上清。10000r/min,4℃,离心5min紧实沉淀,弃上清。5.1.1.6500μLPBS悬浮沉淀。如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min。10000r/min,4℃,离心15min,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。5.1.2硬质表面食品5.1.2.1将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(100cm2)。记录擦拭面积。将10μL过程控制病毒添加至该棉拭子。5.1.2.2将棉拭子浸入含490μLPBS试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3~4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续RNA提取。硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子。5.1.3贝类5.1.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类。5.1.3.2使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中。收集2.0g。5.1.3.3使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管。加入10μL过程控制病毒。加入2.0mL蛋白酶K溶液,混匀。5.1.3.4使用恒温摇床或等效装置,37℃,320次/min,振荡60min。5.1.3.5将试管放入水浴或等效装置,60℃,15min。室温,3000r/min,5min离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液mL数,用于后续RNA提取。5.2病毒RNA提取和纯化注:病毒RNA可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒RNA提取纯化试剂盒。提取完成后,为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的RNA立即进行反应,或保存在4℃小于8h。如果长期储存建议-80℃保存。5.2.1病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积Trizol试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/min,离心5min,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层。5.2.2病毒RNA提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5min,12000r/min,离心5min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。GB4789.42—201655.2.3病毒RNA纯化5.2.3.1每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀2次。5.2.3.2于4℃,12000r/min,离心10min,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶。5.2.3.3加入16μL无RNase超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min,离心5s,冰上保存备用。5.3质量控制5.3.1空白对照以无RNase超纯水作为空白对照(A反应孔)。5.3.2阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取RNA,作为阴性对照(B反应孔)。5.3.3阳性对照以外加扩增控制RNA,作为阳性对照(J反应孔)。5.3.4过程控制病毒5.3.4.1以食品中过程控制病毒RNA的提取效率表示食品中诺如病毒RNA的提取效率,作为病毒提取过程控制。5.3.4.2将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化RNA。可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的RNA量,-80℃保存,每次检测时取出使用。5.3.4.3将10μL过程控制病毒的RNA进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用与诺如病毒实时荧光RT-PCR反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒RNA的Ct值。5.3.4.4以未稀释和梯度稀释过程控制病毒RNA的浓度lg值为X轴,以其Ct值为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应≥0.98。未稀释过程控制病毒RNA浓度为1,梯度稀释过程控制RNA浓度分别为10-1、10-2、10-3等。5.3.4.5将含过程控制病毒食品样品RNA(C反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用诺如病毒实时荧光RT-PCR反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度。5.3.4.6计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度×100%,即(C反应孔)Ct值对应浓度×100%。5.3.5外加扩增控制5.3.5.1通过外加扩增控制RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。5.3.5.2外加扩增控制RNA分别加入含过程控制病毒食品样品RNA(H反应孔)、10-1稀释的含过程控制病毒食品样品RNA(I反应孔)、无RNase超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值。5.3.5.3计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品RNA+外加扩增控制RNA)Ct值GB4789.42—20166-(无RNase超纯水+外加扩增控制RNA)Ct值,即抑制指数=(H反应孔)Ct值-(J反应孔)Ct值。如抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)Ct值-(J反应孔)Ct值。5.4实时荧光RT-PCR实时荧光RT-PCR反应体系和反应参数详见附录B。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化实时荧光RT-PCR试剂盒。也可增加调整反应孔,实现一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测。将18.5μL实时荧光RT-PCR反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒。A反应孔:空白对照,加入5μL无RNase超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控制RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控制RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无RNase超纯水+1μL外加扩增控制RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针。6结果与报告6.1检测有效性判定6.1.1需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照(J反应孔)阳性。6.1.2过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率≥1%;如提取效率1%,需重新检测;但如提取效率1%,检测结果为阳性,也可