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中华人民共和国国家标准GB4789.43—2016食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.43—20161食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定1范围本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法。本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1生物安全柜。2.2冰箱:2℃~5℃。2.3恒温培养箱:36℃±1℃。2.4恒温水浴箱:46℃±1℃。2.5天平:感量为0.1g。2.6振荡器。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌培养皿:直径90mm。2.9无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。2.10pH计或精密pH试纸。2.11无菌纸片:见A.8。2.12无菌镊子。2.13游标卡尺:刻度为0.1mm。3培养基和试剂3.1胰蛋白胨大豆琼脂(TryptoneSoyAgar,TSA):见A.1。3.2胰蛋白胨大豆肉汤(TryptoneSoyBroth,TSB):见A.2。3.3平板计数琼脂(PlateCountAgar):见A.3。3.40.1mol/LHCl:见A.4。3.5无菌生理盐水:见A.5。3.650.0μg/mL环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)溶液:见A.6。3.75.0μg/片环丙沙星纸片:见A.7。4试验菌株4.1金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538。GB4789.43—201624.2大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229。4.3蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC2。4.4环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC4516。4.5化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344。4.6粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。5检验程序微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1。图1微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序6操作步骤6.1试验菌悬液原液制备将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC11229)、蜡样芽孢杆菌(ATCC2)、环状芽孢杆菌(ATCC4516)、化脓性链球菌(ATCC12344)、粘质沙雷菌(ATCC14041)冻存菌株分别接种于GB4789.43—20163盛有5mLTSB的试管,置36℃±1℃培养18h~24h进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培养液1~2环转种于5mLTSB肉汤,置36℃±1℃培养18h~24h进行二次传代培养,作为试验菌悬液原液备用。试验菌悬液原液纯度检测:分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养20h~24h,观察纯度。6.2菌悬液原液浓度测定6.2.1菌悬液原液稀释分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10-4稀释液,金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成10-5稀释液。6.2.2培养计数分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液1mL于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至46℃左右(可放置于46℃±1℃的恒温水浴箱中保温)的平板计数琼脂15mL~20mL,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,于36℃±1℃培养24h后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于106CFU/mL时方可使用。6.3检测平板制备倾注融化并冷却至46℃±1℃的TSA培养基15mL于无菌培养皿内,待其凝固后制成TSA平板,备用。将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46℃±1℃的TSA培养基按1∶10的比例稀释(其中化脓性链球菌ATCC12344按1∶20的比例稀释),充分混匀后各取10mL至上述已制备好、于46℃±1℃中保温的TSA平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。注:为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46℃±1℃条件下保温平衡10min。6.4酶制剂纸片的制备准确称(移)取1.0g(mL)酶制剂于9mL无菌生理盐水中,充分混匀后制成10%的酶制剂溶液。将无菌纸片放入无菌平皿内,在每张纸片上缓缓滴加100μL10%的酶制剂溶液,使其全部吸收,每种酶制剂样品制备12张纸片。6.5贴纸片及培养将6.4中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片(见A.7)和含100μL无菌生理盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置6.3中制备的检测平板上,每个平板贴2张纸片(2张含待测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片),两纸片圆点的间距大于32mm,每个标准菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于4℃±0.5℃冰箱内过夜(12h~16h)。第二天转入36℃±1℃恒温培养箱中培养24h后,测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑菌圈。7抗菌活性结果报告7.1结果判定若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性,即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈GB4789.43—20164(每个抑菌圈直径≥16mm),且阳性对照环丙沙星纸片对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粘质沙雷菌、环状芽孢杆菌、化脓性链球菌5种细菌形成的抑菌圈均16mm,则判定该酶制剂样品中存在抗菌活性物质。7.2结果报告报告样品中检出抗菌活性或未检出抗菌活性。GB4789.43—20165附录A培养基与试剂A.1胰蛋白胨大豆琼脂(TryptoneSoyAgar,TSA)A.1.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化钠5.0g琼脂粉15.0g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,分装至锥形瓶中,121℃灭菌15min。A.2胰蛋白胨大豆肉汤(TryptoneSoyBroth,TSB)A.2.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mLA.2.2制法将上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,分装试管,121℃灭菌15min。A.3平板计数琼脂(PlateCountAgar,PCA)A.3.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLA.3.2制法上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,分装至锥形瓶中,121℃灭菌15min。GB4789.43—20166A.40.1mol/LHClA.4.1成分HCl9mL蒸馏水991mLA.4.2制法移取浓盐酸9mL(质量浓度为36%,密度为1.17g/m3),用无菌蒸馏水稀释至1000mL,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。A.5无菌生理盐水A.5.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.5.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水,121℃灭菌15min。A.650.0μg/mL环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)A.6.1成分1000μg/mL环丙沙星0.5mL无菌生理盐水9.5mLA.6.2制法按产品说明书(百分比,含水量或效价)称取一定质量的环丙沙星用适量0.1mol/LHCl溶解使其浓度为1000μg/mL,无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤后移取0.5mL,用无菌生理盐水稀释至10mL,混匀。A.75.0μg/片环丙沙星纸片(Ciprofloxacinpaper,CIPpaper)A.7.1成分50.0μg/mL环丙沙星100μL无菌纸片1张A.7.2制法吸取50.0μg/mL环丙沙星溶液100μL缓慢均匀滴加于无菌纸片上,制成5.0μg/片环丙沙星纸片。GB4789.43—20167A.8无菌纸片A.8.1要求纸片外观应整洁、无毛边,无明显变形,无破损,pH为中性,厚度0.3mm~0.6mm,60s内吸收100μL蒸馏水。A.8.2制备及储存方法制成标准直径为13.0mm±0.1mm的圆形纸片,置玻璃容器内,密封,121℃灭菌15min后,80℃±5℃干燥4h,备用。