GB 5009.24-2010 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.24—2010食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofaflatoxinsM1andB1infoods中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施GB5009.24—2010I前言本标准代替GB/T5009.24-2003《食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定》。本标准所代替的历次版本发布情况为：——GB/T5009.24-1985、GB/T5009.24-1996、GB/T5009.24-2003。GB5009.24—20101食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定1范围本标准规定了牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织（肝、肾、血及瘦肉）等食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定方法。本标准适用于牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织（肝、肾、血及瘦肉）等食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定。2原理样品经提取、浓缩、薄层分离后，黄曲霉毒素M1与B1在紫外光（波长365nm）下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的昀低检出量来测定含量。3试剂和材料3.1甲醇：分析纯。3.2石油醚：分析纯。3.3三氯甲烷：分析纯。3.4无水硫酸钠：分析纯。3.5异丙醇：分析纯。3.6硅胶G：层析用。3.7氯化钠及氯化钠溶液（40g/L）。3.8硫酸（1+3）。3.9玻璃砂：用酸处理后洗净干燥，约相当20目。3.10黄曲霉毒素M1标准溶液：用三氯甲烷配制成每毫升相当于10μg的黄曲霉毒素M1标准溶液。以三氯甲烷作空白试剂，黄曲霉毒素M1的紫外昀大吸收峰的波长应接近357nm，摩尔消光系数为19950。避光，置于4℃冰箱中保存。3.11黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液：用三氯甲烷配制成每毫升相当于各含0.04μg黄曲霉毒素M1与B1。避光，置于4℃冰箱中保存。4仪器和设备4.110目圆孔筛。4.2小型粉碎机。GB5009.24—201024.3玻璃板：5cm×20cm。4.4展开槽:长25cm，宽6cm，高4cm。4.5紫外光灯：100W～125W，带365nm滤光片。4.6微量注射器。5分析步骤整个操作需在暗室条件下进行。5.1样品提取5.1.1样品提取制备表，见表1。表1试样制备样品名称称样量/（g）加水量/（mL）加甲醇量/（mL）提取液量α/（mL）加40g/L氯化钠溶液量/（mL）浓缩体积/（mL）滴加体积/（μL）方法灵敏度/（μg/kg）牛乳3009062250.41000.1炼乳3009052350.4500.2牛乳粉15209059280.4400.5乳酪1559056310.4400.5奶油1045558000.4400.5猪肝3009059280.4500.2猪肾3009061260.4500.2猪瘦肉3009058290.4500.2猪血3009061260.4500.2α提取液量按式（1）计算：)90(158BAX++×=…………………………………………………（1）式中：X——提取液量，单位为毫升（mL）；A——试样中的水分量，单位为毫升（mL）（牛乳、炼乳及猪组织的取样量为30g，牛乳粉、乳酪的取样量为15g）；B——加水量，单位为毫升（mL)；注：样品中的水分量参照《食物成分表》。因各提取液中含48mL甲醇，需39mL水才能调到甲醇与水之体积比为(55+45)，因此加入40g/L的氯化钠溶液的体积等于甲醇和水的总体积（87mL）减去提取液的体积（mL）。5.1.2乳与炼乳：称取30.00g混匀的样品，置于小烧杯中，再分别用90mL甲醇移于300mL具塞锥形瓶中，盖严防漏。振荡30min，用折叠式快速滤纸滤于100mL具塞量筒中。按表1收集62mL乳与52mL炼乳（各相当于16g样品）提取液。5.1.3乳粉：取15.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，使样品湿润后再加入90mL甲醇，以下按5.1.3自“振荡30min……”起，依法操作，按表1收集59mL提取液（相当于8g样品）。5.1.4干酪：称取15.00g切细、过10目圆孔筛混匀样品，置于具塞锥形瓶中，加5mL水和90mL甲醇，以下按5.1.3自“振荡30min……”起依法操作，按表1收集56mL提取液（相当于8g样品）。5.1.5奶油：称取10.00g样品，置于小烧杯中，用40mL石油醚将奶油溶解并移于具塞锥形瓶中。加45mL水和55mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中。再加入1.5g氯化钠摇动溶GB5009.24—20103解，待分层后，按上表收集80mL提取液（相当于8g样品）于具塞量筒中。5.1.6新鲜猪组织：取新鲜或冷冻保存的猪组织样品（包括肝、肾、血、瘦肉）先切细，混匀后称取30.00g，置于小乳钵中，加玻璃砂少许磨细，新鲜全血用打碎机打匀，或用玻璃珠振摇抗凝。混匀后称取30.00g，将各样品置于300mL具塞锥形瓶中，加入90mL甲醇，以下按5.1.3自“振荡30min……”起依法操作。按上表收集59mL猪肝，61mL猪肾，58mL猪瘦肉及61mL猪血等提取液（各相当于16g样品）。5.2净化5.2.1用石油醚分配净化：将以上收集的提取液移入250mL分液漏斗中，再按各种食品加入一定体积的氯化钠溶液（40g/L）（见表1）。再加入40mL石油醚，振摇2min，待分层后，将下层甲醇-氯化钠水层移于原量筒中，将上层石油醚溶液从分液漏斗上口倒出，弃去。再将量筒中溶液转移于原分液漏斗中。再重复用石油醚提取两次，每次30mL，昀后将量筒中溶液仍移于分液漏斗中。奶油样液总共用石油醚提取两次，每次40mL。5.2.2用三氯甲烷分配提取：于原量筒中加入20mL三氯甲烷，摇匀后，再倒入原分液漏斗中，振摇2min。待分层后，将下层三氯甲烷移于原量筒中，再重复用三氯甲烷提取两次，每次10mL合并于原量筒中。弃去上层甲醇水溶液。5.2.3用水洗三氯甲烷层与浓缩制备：将合并后的三氯甲烷层倒回原分液漏斗中，加入30mL氯化钠溶液（40g/L），振摇30s，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层三氯甲烷层收集于原量筒中。加入10g无水硫酸钠，振摇放置澄清后，将此液经装有少许无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于100mL蒸发皿中。氯化钠水层用10mL三氯甲烷提取一次，并经过滤器一并滤于蒸发皿中。昀后将无水硫酸钠也一起倒于滤纸上，用少量三氯甲烷洗量筒与无水硫酸钠，也一并滤于蒸发皿中，于65℃水浴上通风挥干，用三氯甲烷将蒸发皿中残留物转移于浓缩管中，蒸发皿中残渣太多，则经滤纸滤入浓缩管中。于65℃用减压吹气法将此液浓缩至0.4mL以下，再用少量三氯甲烷洗管壁后，浓缩定量至0.4mL备用。5.3测定5.3.1硅胶G薄层板的制备薄层板厚度为0.3mm，105℃活化2h，在干燥器内可保存1d～2d。5.3.2点板取薄层板（5cm×20cm）两块，距板下端3cm的基线上各滴加两点，在距第一与第二板的左边缘0.8cm～1cm处各滴加10μL黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液，在距各板左边缘2.8cm～3cm处各滴加同一样液点（各种食品的滴加体积见表1），在第二板的第2点上再滴加10μL黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液。一般可将薄层板放在盛有干燥硅胶的层析槽内进行滴加，边加边用冷风机冷风吹干。5.3.3展开5.3.3.1横展：在槽内加入15mL事先用无水硫酸钠脱水的无水乙醚（每500mL无水乙醚中加20g无水硫酸钠）。将薄层板靠近标准点的长边置于槽内，展至板端后，取出挥干，再同上继续展开一次。5.3.3.2纵展：将横展两次挥干后的薄层板再用异丙醇-丙酮-苯-正己烷-石油醚（沸程60℃～90℃）-三氯甲烷（5+10+10+10+10+55）混合展开剂纵展至前沿距原点距离为10cm～12cm取出挥干。5.3.3.3横展：将纵展挥干后的板再用乙醚横展1次～2次，展开方法同5.3.3.1。5.3.4观察与评定结果5.3.4.1在紫外光灯下将第一、二板相互比较观察，若第二板的第二点在黄曲霉毒素M1与B1标准点的相应处出现昀低检出量（M1与B1的比移值依次为0.25和0.43），而在第一板相同位置上未出现荧光GB5009.24—20104点，则样品中黄曲霉毒素M1与B1含量在其所定的方法灵敏度以下（见表1）。5.3.4.2如果第一板的相同位置上出现黄曲霉毒素M1与B1的荧光点，则第二板第二点的样液点是否各与滴加的标准点重叠，如果重叠，再进行以下的定量与确证试验。5.3.5稀释定量样液中的黄曲霉毒素M1与B1荧光点的荧光强度与黄曲霉毒素M1与B1的昀低检出量（0.0004μg）的荧光强度一致，则乳、炼乳、乳粉、干酪与奶油样品中黄曲霉毒素M1与B1的含量依次为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、0.5μg/kg及0.5μg/kg；新鲜猪组织（肝、肾、血、瘦肉）样品均为0.2μg/kg（见表1）。如样液中黄曲霉毒素M1与B1的荧光强度比昀低检出量强，则根据其强度逐一进行测定，估计减少滴加微升数或经稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与昀低检出量点的荧光强度一致为止。5.3.6确证试验在做完定性或定量的薄层板上，将要确证的黄曲霉毒素M1和B1的点用大头针圈出。喷以硫酸溶液(1+3)，放置5min后，在紫外光灯下观察，若样液中黄曲霉毒素M1和B1点与标准点一样均变为黄色荧光，则进一步确证检出的荧光点是黄曲霉毒素M1和B1。6分析结果的表述黄曲霉毒素M1或B1的含量按式（2）进行计算。mDVVX10000004.021×××=…………………………………………（2）式中：X——黄曲霉毒素M1或B1含量，单位为微克每千克（μg/kg）；V1——样液浓缩后体积，单位为毫升(mL)；V2——出现昀低荧光样液的滴加体积，单位为毫升(mL)；D——浓缩样液的总稀释倍数；m——浓缩样液中所相当的试样质量，单位为克(g)；0.0004——黄曲霉毒素M1或B1的昀低检出量，单位为微克（μg）。