GB 5009.32-2016 食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.32—2016食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.32—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.32—2003《油脂中没食子酸丙酯(PG)的测定》和GB/T23373—2009《食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与叔丁基对苯二酚(TBHQ)的测定》。本标准与GB/T5009.32—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定”;———增加了抗氧化剂的种类;———增加了方法的适用范围;———增加了液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱质谱联用法。GB5009.32—20161食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定1范围本标准规定了食品中没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)、没食子酸十二酯(DG)9种抗氧化剂的5种测定方法———高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法、气相色谱法以及比色法。本标准液相色谱法适用于食品中PG、THBP、TBHQ、NDGA、BHA、BHT、Ionox-100、OG、DG的测定;液相色谱串联质谱法适用于食品中THBP、PG、OG、NDGA、DG的测定;气相色谱质谱法适用于食品中BHA、BHT、TBHQ、Ionox-100的测定;气相色谱法适用于食品中BHA、BHT、TBHQ的测定;比色法适用于油脂中PG的测定。第一法高效液相色谱法2原理油脂样品经有机溶剂溶解后,使用凝胶渗透色谱(GPC)净化;固体类食品样品用正己烷溶解,用乙腈提取,固相萃取柱净化。高效液相色谱法测定,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲酸(HCOOH)。3.1.2乙腈(CH3CN)。3.1.3甲醇(CH3OH)。3.1.4正己烷(C6H14):分析纯,重蒸。3.1.5乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)。3.1.6环己烷(C6H12)。3.1.7氯化钠(NaCl):分析纯。3.1.8无水硫酸钠(Na2SO4):分析纯,650℃灼烧4h,贮存于干燥器中,冷却后备用。3.2试剂配制3.2.1乙腈饱和的正己烷溶液:正己烷中加入乙腈至饱和。3.2.2正己烷饱和的乙腈溶液:乙腈中加入正己烷至饱和。GB5009.32—201623.2.3乙酸乙酯和环己烷混合溶液(1+1):取50mL乙酸乙酯和50mL环己烷混匀。3.2.4乙腈和甲醇混合溶液(2+1):取100mL乙腈和50mL甲醇混合。3.2.5饱和氯化钠溶液:水中加入氯化钠至饱和。3.2.6甲酸溶液(0.1+99.9):取0.1mL甲酸移入100mL容量瓶,定容至刻度。3.3标准品3.3.1叔丁基对羟基茴香醚:纯度≥98%。3.3.22,6-二叔丁基对甲基苯酚:纯度≥98%。3.3.3没食子酸辛酯:纯度≥98%。3.3.4没食子酸十二酯:纯度≥98%。3.3.5没食子酸丙酯:纯度≥98%。3.3.6去甲二氢愈创木酸:纯度≥98%。3.3.72,4,5-三羟基苯丁酮:纯度≥98%。3.3.8叔丁基对苯二酚:纯度≥98%。3.3.92,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚:纯度≥98%。注:英文名字、分子式和CAS号见附录A。3.4标准溶液配制3.4.1抗氧化剂标准物质混合储备液:准确称取0.1g(精确至0.1mg)固体抗氧化剂标准物质,用乙腈溶于100mL棕色容量瓶中,定容至刻度,配制成浓度为1000mg/L的标准混合储备液,0℃~4℃避光保存。3.4.2抗氧化剂混合标准使用液:移取适量体积的浓度为1000mg/L的抗氧化剂标准物质混合储备液分别稀释至浓度为20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L的混合标准使用液。3.5材料3.5.1C18固相萃取柱:2000mg/12mL。3.5.2有机系滤膜:孔径0.22μm。4仪器和设备4.1离心机:转速≥3000r/min。4.2旋转蒸发仪。4.3高效液相色谱仪。4.4凝胶渗透色谱仪。4.5分析天平:感量为0.01g和0.1mg。4.6涡旋振荡器。5分析步骤5.1试样制备固体或半固体样品粉碎混匀,然后用对角线法取四分之二或六分之二,或根据试样情况取有代表性试样,密封保存;液体样品混合均匀,取有代表性试样,密封保存。GB5009.32—201635.2测定步骤5.2.1提取5.2.1.1固体类样品:称取1g(精确至0.01g)试样(5.1)于50mL离心管中,加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液,涡旋1min充分混匀,浸泡10min。加入5mL饱和氯化钠溶液,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋2min,3000r/min离心5min,收集乙腈层于试管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,加0.1%甲酸溶液调节pH=4,待净化。同时做空白试验。5.2.1.2油类:称取1g(精确至0.01g)试样(5.1)于50mL离心管中,加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品,涡旋1min,静置10min,用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min,3000r/min离心5min,收集乙腈层于试管中,再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次,合并3次提取液,待净化。同时做空白试验。5.2.2净化在C18固相萃取柱中装入约2g的无水硫酸钠,用5mL甲醇活化萃取柱,再以5mL乙腈平衡萃取柱,弃去流出液。将所有提取液(5.2.1)倾入柱中,弃去流出液,再以5mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脱,收集所有洗脱液于试管中,40℃下旋转蒸发至干,加2mL乙腈定容,过0.22μm有机系滤膜,供液相色谱测定。5.2.3凝胶渗透色谱法(纯油类样品可选)称取样品(5.1)10g(精确至0.01g)于100mL容量瓶中,以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度,作为母液;取5mL母液于10mL容量瓶中以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度,待净化。取10mL待测液加入凝胶渗透色谱(GPC)进样管中,使用GPC净化(凝胶渗透色谱净化条件见附录B),收集流出液,40℃下旋转蒸发至干,加2mL乙腈定容,过0.22μm有机系滤膜,供液相色谱测定。同时做空白试验。5.3液相色谱仪条件a)色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效色谱柱;b)流动相A:0.5%甲酸水溶液,流动相B:甲醇;c)洗脱梯度:0~5min流动相(A)50%,5min~15min:流动相(A)从50%降至20%,15min~20min流动相(A)20%,20min~25min:流动相(A)从20%降至10%,25min~27min:流动相(A)从10%增至50%,27min~30min:流动相(A)50%;d)柱温:35℃;e)进样量:5μL;f)检测波长:280nm。5.4标准曲线的制作将系列浓度的标准工作液分别注入液相色谱仪中,测定相应的抗氧化剂,以标准工作液的浓度为横坐标,以响应值(如:峰面积、峰高、吸收值等)为纵坐标,绘制标准曲线。9种抗氧化剂液相色谱图见附录C。5.5试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到相应色谱峰的响应值,根据标准曲线得到待测液中抗氧化GB5009.32—20164剂的浓度。6分析结果的表述试样中抗氧化剂含量按式(1)计算:Xi=ρi×Vm…………………………(1)式中:Xi———试样中抗氧化剂含量,单位为毫克每千克(mg/kg);ρi———从标准曲线上得到的抗氧化剂溶液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———样液最终定容体积,单位为毫升(mL);m———称取的试样质量,单位为克(g)。结果保留三位有效数字(或保留到小数点后两位)。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他本方法的检出限为没食子酸丙酯(PG):2mg/kg,2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP):4mg/kg,叔丁基对苯二酚(TBHQ):10mg/kg,去甲二氢愈创木酸(NDGA):4mg/kg,叔丁基对羟基茴香醚(BHA):10mg/kg,2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100):20mg/kg,没食子酸辛酯(OG):2mg/kg,2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT):4mg/kg,没食子酸十二酯(DG):10mg/kg;定量限均为20mg/kg。第二法液相色谱串联质谱法9原理油脂样品经有机溶剂溶解后,使用凝胶渗透色谱(GPC)净化;固体类食品样品用正己烷溶解,用乙腈提取,固相萃取柱净化。液相色谱串联质谱联用仪测定,外标法定量。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂同3.110.2试剂配制同3.2GB5009.32—2016510.3标准品10.3.1没食子酸辛酯:纯度≥98%。10.3.2没食子酸十二酯:纯度≥98%。10.3.3没食子酸丙酯:纯度≥98%。10.3.4去甲二氢愈创木酸:纯度≥98%。10.3.52,4,5-三羟基苯丁酮:纯度≥98%。注:英文名字、分子式和CAS号参见附录A。10.4标准溶液配制10.4.1标准物质储备液:准确称取0.1g(精确至0.1mg)固体抗氧化剂标准物质,用乙腈溶于100mL棕色容量瓶中,定容至刻度,配置成浓度为1000mg/L的标准储备液,0℃~4℃避光保存。10.4.2标准物质中间液:移取标准物质储备液1.0mL于100mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成浓度为10mg/L的混合标准中间液,0℃~4℃避光保存。10.4.3标准物质使用液:移取适量体积的标准物质中间液分别稀释至浓度为0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的混合标准使用液。10.5材料同3.5。11仪器和设备11.1离心机:转速≥3000r/min。11.2旋转蒸发仪。11.3液相色谱串联质谱仪。11.4凝胶渗透色谱仪。11.5分析天平:感量为0.01g和0.1mg。11.6涡旋振荡器。12分析步骤12.1试样制备同5.1。12.2测定步骤同5.2。12.3液相色谱-串联质谱仪条件a)色谱柱:C18键合硅胶色谱柱,柱长50mm,内径2.0mm,粒径1.8μm,或等效色谱柱;b)流动相A:水,流动相B:乙腈;c)流速:0.2mL/min;d)洗脱梯度:0~3min:流动相(B)从10%至30%,3min~5min:流动相(B)30%,5min~GB5009.32—2016610min:流动相(B)从30%至80%,10min~12min:流动相(B)80%,12min~12.01min流动相(B)从80%至10%,12.01min~14min:流动相(B)10%;e)柱温:35℃;f)进样量:2μL;g)电离源模式:电喷雾离子化;h)喷雾流速:3L/min;i)干燥气流速:15L/min;j)离子喷雾电压:3500V;k)监测离子对、碰撞能量、驻留时间和保留时间见附录D。12.4定性测定在相同试验条件下进行样品测定时,如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致,并且在扣除背景后的样品质谱图中,所选择的离子均出现,而且所选择的离子丰度比与标准样品相一致(相对丰度50%,允许±20%偏差;相对丰度20%~50%,允许±25%偏差;相对丰度10%~20%,允许±30%偏差;相对丰度≤10%,允许±50%偏差),则可判断样品中存在这种抗氧化剂。12.5标准曲线的制作将标准系列工作液进行液相色谱串联质谱仪测定,以定量离子对峰面积对应标准溶液浓度绘制标准曲线。9种抗氧化