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书书书!#$%&’’()*犌犅５００９．８２—２０１６!#$%&’(!)*+,犃、犇、犈-./２０１６１２２３01２０１７０６２３23!#$%&’’(+,&-.,/012’(34546789:;01书书书犌犅５００９．８２—２０１６Ⅰ 前 言 本标准代替ＧＢ／Ｔ５００９．８２—２００３《食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定》、ＧＢ５４１３．９—２０１０《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素Ａ、Ｄ、Ｅ的测定》、ＧＢ／Ｔ９６９５．２６—２００８《肉与肉制品 维生素Ａ含量测定》、ＧＢ／Ｔ９６９５．３０—２００８《肉与肉制品 维生素Ｅ含量测定》、ＮＹ／Ｔ１５９８—２００８《食用植物油中维生素Ｅ组分和含量的测定 高效液相色谱法》。本标准与ＧＢ／Ｔ５００９．８２—２００３相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中维生素Ａ、Ｄ、Ｅ的测定”；———增加了“食品中维生素Ｅ的测定 正相高效液相色谱法”；———增加了“食品中维生素Ｄ的测定 液相色谱串联质谱法”；———增加了“食品中维生素Ｄ的测定 高效液相色谱法”；———修改了“食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定 反相高效液相色谱法”；———修改了维生素Ｅ异构体的反相色谱分离条件，可同时分离测定４种生育酚异构体；———删除了苯并芘内标定量法，改用外标法定量；———删除了“比色法”测定维生素Ａ。犌犅５００９．８２—２０１６１ 食品安全国家标准食品中维生素犃、犇、犈的测定１ 范围本标准规定了食品中维生素Ａ、维生素Ｅ和维生素Ｄ的测定方法。本标准第一法适用于食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定。本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素Ｅ的测定。本标准第三法适用于食品中维生素Ｄ２和维生素Ｄ３的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素Ｄ２或维生素Ｄ３的测定。第一法 食品中维生素犃和维生素犈的测定 反相高效液相色谱法２ 原理试样中的维生素Ａ及维生素Ｅ经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，Ｃ３０或ＰＦＰ反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。３ 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１ 试剂３．１．１ 无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：经检查不含醛类物质，检查方法参见Ａ．１。３．１．２ 抗坏血酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）。３．１．３ 氢氧化钾（ＫＯＨ）。３．１．４ 乙醚［（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ］：经检查不含过氧化物，检查方法参见Ａ．２。３．１．５ 石油醚（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）：沸程为３０℃～６０℃。３．１．６ 无水硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ４）。３．１．７ ｐＨ试纸（ｐＨ范围１～１４）。３．１．８ 甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。３．１．９ 淀粉酶：活力单位≥１００Ｕ／ｍｇ。３．１．１０ ２，６二叔丁基对甲酚（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）：简称ＢＨＴ。３．２ 试剂配制３．２．１ 氢氧化钾溶液（５０ｇ／１００ｇ）：称取５０ｇ氢氧化钾，加入５０ｍＬ水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。３．２．２ 石油醚乙醚溶液（１＋１）：量取２００ｍＬ石油醚，加入２００ｍＬ乙醚，混匀。犌犅５００９．８２—２０１６２ ３．２．３ 有机系过滤头（孔径为０．２２μｍ）。３．３ 标准品３．３．１ 维生素犃标准品视黄醇（Ｃ２０Ｈ３０Ｏ，ＣＡＳ号：６８２６８）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２ 维生素犈标准品３．３．２．１ α生育酚（Ｃ２９Ｈ５０Ｏ２，ＣＡＳ号：１０１９１４１０）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．２ β生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：１４８０３８）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．３ γ生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：５４２８４）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．４ δ生育酚（Ｃ２７Ｈ４６Ｏ２，ＣＡＳ号：１１９１３１）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．４ 标准溶液配制３．４．１ 维生素Ａ标准储备溶液（０．５００ｍｇ／ｍＬ）：准确称取２５．０ｍｇ维生素Ａ标准品，用无水乙醇溶解后，转移入５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为０．５００ｍｇ／ｍＬ。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在－２０℃下避光保存，有效期１个月。临用前将溶液回温至２０℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录Ｂ）。３．４．２ 维生素Ｅ标准储备溶液（１．００ｍｇ／ｍＬ）：分别准确称取α生育酚、β生育酚、γ生育酚和δ生育酚各５０．０ｍｇ，用无水乙醇溶解后，转移入５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为１．００ｍｇ／ｍＬ。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在－２０℃下避光保存，有效期６个月。临用前将溶液回温至２０℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录Ｂ）。３．４．３ 维生素Ａ和维生素Ｅ混合标准溶液中间液：准确吸取维生素Ａ标准储备溶液１．００ｍＬ和维生素Ｅ标准储备溶液各５．００ｍＬ于同一５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素Ａ浓度为１０．０μｇ／ｍＬ，维生素Ｅ各生育酚浓度为１００μｇ／ｍＬ。在－２０℃下避光保存，有效期半个月。３．４．４ 维生素Ａ和维生素Ｅ标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素Ａ和维生素Ｅ混合标准溶液中间液０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素Ａ浓度为０．２０μｇ／ｍＬ、０．５０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、２．００μｇ／ｍＬ、４．００μｇ／ｍＬ、６．００μｇ／ｍＬ，维生素Ｅ浓度为２．００μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬ、４０．０μｇ／ｍＬ、６０．０μｇ／ｍＬ。临用前配制。４ 仪器和设备４．１ 分析天平：感量为０．０１ｍｇ。４．２ 恒温水浴振荡器。４．３ 旋转蒸发仪。４．４ 氮吹仪。４．５ 紫外分光光度计。４．６ 分液漏斗萃取净化振荡器。犌犅５００９．８２—２０１６３ ４．７ 高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。５ 分析步骤５．１ 试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。５．２ 试样处理警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。５．２．１ 皂化５．２．１．１ 不含淀粉样品称取２ｇ～５ｇ（精确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（精确至０．０１ｇ）液体试样于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需加入约２０ｍＬ温水，混匀，再加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀，加入３０ｍＬ无水乙醇，加入１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于８０℃恒温水浴震荡皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。注：皂化时间一般为３０ｍｉｎ，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。５．２．１．２ 含淀粉样品称取２ｇ～５ｇ（精确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（精确至０．０１ｇ）液体样品于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需用约２０ｍＬ温水混匀，加入０．５ｇ～１ｇ淀粉酶，放入６０℃水浴避光恒温振荡３０ｍｉｎ后，取出，向酶解液中加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀，加入３０ｍＬ无水乙醇，１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于８０℃恒温水浴振荡皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。５．２．２ 提取将皂化液用３０ｍＬ水转入２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ石油醚乙醚混合液，振荡萃取５ｍｉｎ，将下层溶液转移至另一２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ的混合醚液再次萃取，合并醚层。注：如只测维生素Ａ与α生育酚，可用石油醚作提取剂。５．２．３ 洗涤用约１００ｍＬ水洗涤醚层，约需重复３次，直至将醚层洗至中性（可用ｐＨ试纸检测下层溶液ｐＨ值），去除下层水相。５．２．４ 浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约３ｇ）滤入２５０ｍＬ旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约１５ｍＬ石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠２次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于４０℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约２ｍＬ时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至１０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。溶液过０．２２μｍ有机系滤膜后供高效液相色谱测定。犌犅５００９．８２—２０１６４ ５．３ 色谱参考条件色谱参考条件列出如下：ａ） 色谱柱：Ｃ３０柱（柱长２５０ｍｍ，内径４．６ｍｍ，粒径３μｍ），或相当者；ｂ） 柱温：２０℃；ｃ） 流动相：Ａ：水；Ｂ：甲醇，洗脱梯度见表１；ｄ） 流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ） 紫外检测波长：维生素Ａ为３２５ｎｍ；维生素Ｅ为２９４ｎｍ；ｆ） 进样量：１０μＬ；ｇ） 标准色谱图和样品色谱图见Ｃ．１。注１：如难以将柱温控制在２０℃±２℃，可改用ＰＦＰ柱分离异构体，流动相为水和甲醇梯度洗脱。注２：如样品中只含α生育酚，不需分离β生育酚和γ生育酚，可选用Ｃ１８柱，流动相为甲醇。注３：如有荧光检测器，可选用荧光检测器检测，对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性，可按以下检测波长检测：维生素Ａ激发波长３２８ｎｍ，发射波长４４０ｎｍ；维生素Ｅ激发波长２９４ｎｍ，发射波长３２８ｎｍ。表１ 犆３０色谱柱反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间ｍｉｎ流动相Ａ％流动相Ｂ％流速ｍＬ／ｍｉｎ０．０４９６０．８１３．０４９６０．８２０．００１０００．８２４．００１０００．８２４．５４９６０．８３０．０４９６０．８５．４ 标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素Ａ和维生素Ｅ标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。５．５ 样品测定试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定１０个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。６ 分析结果的表述试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的含量按式（１）计算：犡＝ρ×犞×犳×１００犿……………………（１） 式中：犡 ———试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的含量，维生素Ａ单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ），维生素Ｅ单位为毫克每百克（ｍｇ／１００ｇ）；ρ———根据标准曲线计算得到的试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犌犅５００９．８２—２０１６５ 犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———换算因子（维生素Ａ：犳＝１；维生素Ｅ：犳＝０．００１）；１００———试样中量以每１００克计算的换算系数；犿———试样的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果保留三位有效数字。注：如维生素Ｅ的测定结果要用α生育酚当量（αＴＥ）表示，可按下式计算：维生素Ｅ（ｍｇαＴＥ／１００ｇ）＝α生育酚（ｍｇ／１００ｇ）＋β生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．５＋γ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．１＋δ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．０１。７ 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。８ 其他当取样量为５ｇ，定容１０ｍＬ时，维生素Ａ的紫外检出限为１０μｇ／１００ｇ，定量限为３０μｇ／１００ｇ；生育酚的紫外检出限为４０μｇ／１００ｇ，定量限为１２０μｇ／１００ｇ。第二法 食品中维生素犈的测定 正相高效液相色谱法９ 原理试样中的维生素Ｅ经有机溶剂提取、浓缩后，用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离，经荧光检测器检测，外标法定量。１０ 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。１０．１ 试剂１０．１．１ 无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见Ａ．１。１０．１．２ 乙醚［（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ］：分析纯