GB 5009.86-2016 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.86—2016食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布GB5009.86—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2,4-二硝基苯肼法)》、GB/T5009.159—2003《食品中还原型抗坏血酸的测定》和GB6195—1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法(2,6-二氯靛酚滴定法)》。本标准与GB/T5009.86—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定”;———扩大了方法的适用范围;———增加了高效液相色谱法及相关方法的定量限;———删除了2,4-二硝基苯肼法;———增加了2,6-二氯靛酚滴定法;———按照GB/T20001.4—2015对原标准的结构进行了修改。GB5009.86—20161食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定1范围本标准规定了高效液相色谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法测定食品中抗坏血酸的方法。本标准第一法适用于乳粉、谷物、蔬菜、水果及其制品、肉制品、维生素类补充剂、果冻、胶基糖果、八宝粥、葡萄酒中的L(+)-抗坏血酸、D(-)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸总量的测定。第二法适用于乳粉、蔬菜、水果及其制品中L(+)-抗坏血酸总量的测定。第三法适用于水果、蔬菜及其制品中L(+)-抗坏血酸的测定。2术语和定义2.1抗坏血酸:一种具有抗氧化性质的有机化合物。又称为“维生素C”,是人体必需的营养素之一。2.2L(+)-抗坏血酸:左式右旋光抗坏血酸。具有强还原性,对人体具有生物活性。2.3D(-)-抗坏血酸:又称异抗坏血酸。具有强还原性,但对人体基本无生物活性。2.4L(+)-脱氢抗坏血酸:L(+)-抗坏血酸极易被氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸,L(+)-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L(+)-抗坏血酸。通常称为脱氢抗坏血酸。2.5L(+)-抗坏血酸总量:将试样中L(+)-脱氢抗坏血酸还原成的L(+)-抗坏血酸或将试样中L(+)-抗坏血酸氧化成的L(+)-脱氢抗坏血酸后测得的L(+)-抗坏血酸总量。第一法高效液相色谱法3原理试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后,以离子对试剂为流动相,经反相色谱柱分离,其中L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245nm)测定;试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后,用紫外检测器(波长245nm)测定L(+)-抗坏血酸总量,或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时间定性,外标法定量。4试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。4.1试剂4.1.1偏磷酸(HPO3)n:含量(以HPO3计)≥38%。4.1.2磷酸三钠(Na3PO4·12H2O)。4.1.3磷酸二氢钾(KH2PO4)。GB5009.86—201624.1.4磷酸(H3PO4):85%。4.1.5L-半胱氨酸(C3H7NO2S):优级纯。4.1.6十六烷基三甲基溴化铵(C19H42BrN):色谱纯。4.1.7甲醇(CH3OH):色谱纯。4.2试剂配制4.2.1偏磷酸溶液(200g/L):称取200g(精确至0.1g)偏磷酸(4.1.1),溶于水并稀释至1L,此溶液保存于4℃的环境下可保存一个月。4.2.2偏磷酸溶液(20g/L):量取50mL200g/L偏磷酸溶液,用水稀释至500mL。4.2.3磷酸三钠溶液(100g/L):称取100g(精确至0.1g)磷酸三钠,溶于水并稀释至1L。4.2.4L-半胱氨酸溶液(40g/L):称取4gL-半胱氨酸,溶于水并稀释至100mL。临用时配制。4.3标准品4.3.1L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度≥99%。4.3.2D(-)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C6H8O6):纯度≥99%。4.4标准溶液配制4.4.1L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL):准确称取L(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01mg),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。4.4.2D(-)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL):准确称取D(-)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01mg),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。4.4.3抗坏血酸混合标准系列工作液:分别吸取L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸标准贮备液0mL,0.05mL,0.50mL,1.0mL,2.5mL,5.0mL,用20g/L的偏磷酸溶液定容至100mL。标准系列工作液中L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL。临用时配制。5仪器和设备5.1液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。5.2pH计:精度为0.01。5.3天平:感量为0.1g、1mg、0.01mg。5.4超声波清洗器。5.5离心机:转速≥4000r/min。5.6均质机。5.7滤膜:0.45μm水相膜。5.8振荡器。6分析步骤整个检测过程尽可能在避光条件下进行。6.1试样制备6.1.1液体或固体粉末样品:混合均匀后,应立即用于检测。GB5009.86—201636.1.2水果、蔬菜及其制品或其他固体样品:取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液,经均质机均质并混合均匀后,应立即测定。6.2试样溶液的制备称取相对于样品约0.5g~2g(精确至0.001g)混合均匀的固体试样或匀浆试样,或吸取2mL~10mL液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03mg~6mg]于50mL烧杯中,用20g/L的偏磷酸溶液(4.2.2)将试样转移至50mL容量瓶中,震摇溶解并定容。摇匀,全部转移至50mL离心管中,超声提取5min后,于4000r/min离心5min,取上清液过0.45μm水相滤膜,滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的含量]。6.3试样溶液的还原准确吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中,加入10mL40g/L的L-半胱氨酸溶液(4.2.4),用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0~7.2,以200次/min振荡5min。再用磷酸调节pH至2.5~2.8,用水将试液全部转移至50mL容量瓶中,并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45μm水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]。若试样含有增稠剂,可准确吸取4mL经L-半胱氨酸溶液还原的试液,再准确加入1mL甲醇,混匀后过0.45μm滤膜后待测。6.4仪器参考条件6.4.1色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或同等性能的色谱柱。6.4.2检测器:二极管阵列检测器或紫外检测器。6.4.3流动相:A:6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵,用水溶解并定容至1L(用磷酸调pH至2.5~2.8);B:100%甲醇。按A∶B=98∶2混合,过0.45μm滤膜,超声脱气。6.4.4流速:0.7mL/min。6.4.5检测波长:245nm。6.4.6柱温:25℃。6.4.7进样量:20μL。6.5标准曲线制作分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定,以L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]标准溶液的质量浓度(μg/mL)为横坐标,L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]的峰高或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线或计算回归方程。L(+)-抗坏血酸、D(-)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1。6.6试样溶液的测定对试样溶液进行测定,根据标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]的浓度(μg/mL)。6.7空白试验空白试验系指除不加试样外,采用完全相同的分析步骤、试剂和用量,进行平行操作。7分析结果的表述试样中L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]的含量和L(+)-抗坏血酸总量以毫克每百克表示,GB5009.86—20164按式(1)计算:X=(c1-c0)×Vm×1000×F×K×100…………………………(1)式中:X———试样中L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸、L(+)-抗坏血酸总量]的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);c1———样液中L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);c0———样品空白液中L(+)-抗坏血酸[或D(-)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———试样的最后定容体积,单位为毫升(mL);m———实际检测试样质量,单位克(g);1000———换算系数(由μg/mL换算成mg/mL的换算因子);F———稀释倍数(若使用6.3还原步骤时,即为2.5);K———若使用6.3中甲醇沉淀步骤时,即为1.25;100———换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他固体样品取样量为2g时,L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的检出限均为0.5mg/100g,定量限均为2.0mg/100g。液体样品取样量为10g(或10mL)时,L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的检出限均为0.1mg/100g(或0.1mg/100mL),定量限均为0.4mg/100g(或0.4mg/100mL)。第二法荧光法10原理试样中L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹唔啉(quinoxaline),其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定试样中L(+)-抗坏血酸总量。注:L(+)-脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。11试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。11.1试剂11.1.1偏磷酸(HPO3)n:含量(以HPO3计)≥38%。11.1.2冰乙酸(CH3COOH):浓度约为30%。GB5009.86—2016511.1.3硫酸(H2SO4):浓度约为98%。11.1.4乙酸钠(CH3COONa)。11.1.5硼酸(H3BO3)。11.1.6邻苯二胺(C6H8N2)。11.1.7百里酚蓝(C27H30O5S)。11.1.8活性炭粉。11.2试剂的配制11.2.1偏磷酸-乙酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水,加温,搅拌,使之逐渐溶解,冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7d~10d。11.2.2硫酸溶液(0.15mol/L):取8.3mL硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1000mL。11.2.3偏磷酸-乙酸-硫酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸,滴加0.15mol/L硫酸溶液至溶解,并稀释至500mL。11.2.4乙酸钠溶液(500g/L):称取500g乙酸钠,加水至1000mL。11.2.5硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL。临用时配制。11.2.6邻苯二胺溶液(200mg/L):称取20mg邻苯二胺,用水溶解并稀释至100mL,临用时配制。11.2.7酸性活性炭:称取约200g活性炭粉(75μm~177μm),加入1L盐酸(1+9),加热回流1h~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110℃~120℃烘箱中干燥10h,备用。检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述