GB 5009.111-2016 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.111—2016食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.111—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.111—2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》、GB/T23503—2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T1571—2005《进出口粮谷中呕吐毒素检验方法液相色谱法》。本标准与GB/T5009.111—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定”;———增加了方法的适用范围;———增加了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇乙酰化衍生物的测定;———增加了同位素稀释液相色谱-串联质谱法;———增加了固相萃取柱净化的前处理方式;———增加了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法;———增加了商业化免疫亲和柱评价技术参数要求。GB5009.111—20161食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定1范围本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定方法。第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法,适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第三法为薄层色谱测定法,第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法2原理试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水和乙腈的混合溶液提取,提取上清液经固相萃取柱或免疫亲和柱净化,浓缩、定容和过滤后,超高压液相色谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.2甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.3正己烷(C6H14)。3.1.4氨水(NH3·H2O)。3.1.5甲酸(HCOOH)。3.1.6氮气(N2):纯度≥99.9%。3.2试剂配制3.2.1乙腈-水溶液(84+16):量取160mL水加入到840mL乙腈中,混匀。3.2.2乙腈饱和的正己烷溶液:量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中,加入少量乙腈,剧烈振摇数分钟,静置分层,弃去下层乙腈层即得。GB5009.111—201623.2.3甲醇-水溶液(5+95):量取5mL甲醇加入到95mL水中,混匀。3.2.40.01%氨水溶液:取100μL氨水加入到1000mL水中,混匀(仅供离子源模式为ESI-时使用)。3.2.50.1%甲酸溶液:取1mL甲酸加入到1000mL水中,混匀(仅供离子源模式为ESI+时使用)。3.3标准品3.3.1脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON,C15H20O6,CAS号:51481-10-8):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.23-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON,C17H22O7,CAS号:50722-38-8):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.315-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON,C17H22O7,CAS号:88337-96-6):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.413C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13C-DON,13C15H20O6):25μg/mL,纯度≥99%。3.3.513C17-3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13C-3-ADON,13C17H22O7):25μg/mL,纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备溶液(100μg/mL):分别称取DON、3-ADON和15-ADON1mg(准确至0.01mg),分别用乙腈溶解并定容至10mL。将溶液转移至试剂瓶中,在-20℃下密封保存,有效期1年。3.4.2混合标准工作溶液(10μg/mL):准确吸取100μg/mLDON、3-ADON和15-ADON标准储备液各1.0mL于同一10mL容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存,有效期半年。3.4.3混合同位素内标工作液(1μg/mL):准确吸取13C15-DON和13C17-3-ADON同位素内标(25μg/mL)各1mL于同一25mL容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存,有效期半年。3.4.4标准系列工作溶液:准确移取适量混合标准工作溶液和混合同位素内标工作液,用初始流动相配制成10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL的混合标准系列,其中同位素内标浓度为100ng/mL。标准系列溶液于4℃保存,有效期7d。4仪器和设备4.1液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。4.2电子天平:感量0.01g和0.00001g。4.3高速粉碎机:转速10000r/min。4.4匀浆机。4.5筛网:0.5mm~1mm孔径。4.6超声波/涡旋振荡器或摇床。4.7氮吹仪。4.8高速离心机:转速不低于12000r/min。4.9移液器:量程10μL~100μL和100μL~1000μL。4.10固相萃取装置。4.11通用型固相萃取柱:兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯)吸附剂填料的固相萃取小柱,200mg,6mL,或相当者。4.12DONs专用型固相净化柱,或相当者。4.13脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱:柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见A.2)。GB5009.111—201634.14水相微孔滤膜:0.22μm。5分析步骤5.1试样制备5.1.1谷物及其制品:取至少1kg样品,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于0.5mm~1mm孔径试验筛,混合均匀后缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。5.1.2酒类:取散装酒至少1L,对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号),将所有液体试样在一个容器中用均质机混匀后,缩分至100g(mL)储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。含二氧化碳的酒类样品使用前应先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气后方可使用。5.1.3酱油、醋、酱及酱制品:取至少1L样品,对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,缩分至100g(mL)储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。5.2试样提取5.2.1谷物及其制品:称取2g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入400μL混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min,收集上清液A于干净的容器中备用。5.2.2酒类:称取5g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入200μL混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min,用乙腈定容至10mL,混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min,收集上清液B于干净的容器中备用。5.2.3酱油、醋、酱及酱制品:称取2g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入400μL混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min,收集上清液C于干净的容器中备用。5.3试样净化注:下述试样的净化方法,可根据实际情况,选择其中一种方法即可。5.3.1通用型固相萃取柱净化取5mL上清液A或上清液B或上清液C置于50mL离心管中,加入10mL乙腈饱和正己烷溶液,涡旋混合2min,5000r/min离心2min,弃去正己烷层后,于40℃~50℃下氮气吹干,加入4mL水充分溶解残渣,待净化。将固相萃取柱连接到固相萃取装置,先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。将4mL上述水复溶液上柱,控制流速为每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻底抽干。用4mL甲醇洗脱,收集全部洗脱液后在40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0mL初始流动相溶解残留物,涡旋混匀10s,用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中,待进样。5.3.2DONs专用型固相净化柱净化取8mL上清液A或上清液B或上清液C至DONs专用型固相净化柱的玻璃管内,将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管至净化液析出,移取5mL净化液于40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0mL初始流动相溶解残留物,涡旋混匀10s,用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中,待进样。注:使用不同厂商的DONs专用型固相净化柱,在上样、净化等操作方面可能略有不同,可按照说明书要求进行操作。GB5009.111—201645.3.3免疫亲和柱净化事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。准确移取5mL上清液A或上清液B或上清液C,于40℃~50℃下氮气吹干,加入2mL水充分溶解残渣,待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节下滴速度,控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中。用5mLPBS缓冲盐溶液和5mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速约为每秒1滴~2滴,直至空气进入亲和注中,弃去全部流出液,抽干小柱。准确加入2mL甲醇洗脱亲和柱,控制每秒1滴的下滴速度,收集全部洗脱液至试管中,在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加入1.0mL初始流动相,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。注:使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照说明书要求进行操作。5.4液相色谱-串联质谱参考条件(可根据实际情况参考其中一种方法即可)5.4.1离子源模式:ESI+液相色谱-质谱参考条件列出如下:a)液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;b)流动相:A相:0.1%甲酸溶液;B相:0.1%甲酸-乙腈;c)梯度洗脱:2%B(0min~0.8min),24%B(3.0min~4.0min),100%B(6.0min~6.9min),2%B(6.9min~7.0min);d)流速:0.35mL/min;e)柱温:40℃;f)进样体积:10μL;g)毛细管电压:3.5kV;锥孔电压:30V;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:900L/h;h)脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表1。表1脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱参考条件(ESI+)化合物名称母离子(m/z)锥孔电压eV定量离子(m/z)碰撞电压eV定性离子(m/z)碰撞电压eVDON2972024910203163-ADON33917231132031315-ADON339181379321713C-DON31220263102451613C-3-ADON3561724513——注:3-ADON和15-ADON为同分异构体,15-ADON可选用13C-3-ADON作为同位素内标进行相应的定量计算。5.4.2离子源模式:ESI-液相色谱-质谱参考条件列出如下:a)液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;b)流动相:A相:0.01%氨水溶液;B相:乙腈;GB5009.111—20165c)梯度洗脱:2%B(0min~0.8min),24%B(3.0min~4.0min),100%B(6.0min~6