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中华人民共和国国家标准GB5009.118—2016食品安全国家标准食品中T-2毒素的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.118—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.118—2008《谷物中T-2毒素的测定》、GB/T23501—2009《食品中T-2毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T1771—2006《进出口粮谷中T-2毒素的测定免疫亲和柱-液相色谱法》、SN/T2676—2010《进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法》。本标准与GB/T5009.118—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中T-2毒素的测定”;———增加了适用范围;———增加了直接ELISA法二。GB5009.118—20161食品安全国家标准食品中T-2毒素的测定1范围本标准规定了食品中T-2毒素的测定方法。本标准第一法适用于粮食及粮食制品,酒类,酱油、醋、酱及酱制品中T-2毒素含量的测定,第二法、第三法适用于粮食及粮食制品中T-2毒素的测定。第一法免疫亲和层析净化液相色谱法2原理用提取液提取试样中的T-2毒素,经免疫亲和柱净化、衍生后,用高效液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.3甲苯(C6H5CH3):色谱纯。3.1.44-二甲基氨基吡啶。3.1.51-蒽腈(1-anthroylnitrile,1-AN)。3.2试剂配制3.2.1提取液:甲醇-水(8∶2,体积比)。3.2.24-二甲基氨基吡啶溶液:准确称取0.0325g4-二甲基氨基吡啶于100mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。3.2.31-蒽腈溶液:准确称取0.030g1-蒽腈于100mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。3.3标准品T-2毒素(C24H34O9,CAS号:21259-20-1):纯度≥98.0%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备液:准确称取适量的T-2毒素标准品(精确至0.0001g),用乙腈溶解,配制成浓度为GB5009.118—20162100μg/mL的标准储备液,-18℃以下避光保存。3.4.2标准工作液:根据需要准确吸取适量的标准储备液,用乙腈稀释,配制成5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准工作液,4℃避光保存。3.5材料3.5.1T-2毒素免疫亲和柱:柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng,或等效柱。3.5.2玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm,无荧光特性。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪:配有荧光检测器。4.2高速粉碎机:转速≥12000r/min。4.3均质器:转速≥12000r/min。4.4氮吹仪。4.5离心机。4.6涡旋混合仪。4.7空气压力泵。4.8试验筛:孔径1.0mm。4.9天平:感量0.0001g和0.01g。4.10超声波发生器:功率180W。4.11玻璃注射器:10mL。5分析步骤5.1提取5.1.1粮食及粮食制品将样品研磨,硬质的粮食等用高速粉碎机磨细并通过试验筛。称取25.0g(精确到0.1g)试样于烧杯中,用提取液溶解,转移至容量瓶中,用提取液定容至100mL,混匀,涡旋振荡提取10min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.1.2酱油、醋、酱及酱制品称取25.0g(精确到0.1g)混匀的试样,用甲醇定容至50.0mL,超声提取10min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.1.3酒类取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g(精确到0.1g)于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.2净化和洗脱将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL5.1中的提取滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至空气进GB5009.118—20163入亲和柱中。用10mL水淋洗亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液,抽干小柱。准确加入1.0mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收集洗脱液。5.3衍生5.3.1标准工作液的衍生:取不同浓度的标准工作液各1mL,在50℃下用氮气吹干,加入50μL4-二甲基氨基吡啶溶液和50μL1-蒽腈溶液,在涡旋混合器上混匀1min,50℃反应15min,在冰水中冷却10min后取出,50℃下氮气吹干,用1.0mL流动相溶解,待HPLC测定。5.3.2样品的衍生:将5.2中洗脱液在50℃下用氮气吹干,按5.3.1步骤进行。5.4测定5.4.1高效液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;b)流动相:乙腈-水(75∶25,体积比);c)流速:1.0mL/min;d)检测波长:激发波长381nm,发射波长470nm;e)进样量:20μL;f)柱温:35℃。5.4.2色谱测定在5.4.1色谱条件下,将系列T-2毒素标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪。待仪器稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算:y=ax+b…………………………(1)式中:y———目标物质的峰面积比;a———回归曲线的斜率;x———目标物质的浓度;b———回归曲线的截距。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线范围,需稀释后再测定。5.5空白试验不称取试样,按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5.6结果计算试样中T-2毒素的含量按式(2)计算:X=ρ×V×1000m×1000×f…………………………(2)式中:X———试样中T-2毒素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);ρ———试样测定液中T-2毒素的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———衍生化后的定容体积,单位为毫升(mL);GB5009.118—201641000———单位换算常数;m———试样的称样量,单位为克(g);f———稀释倍数。注:计算结果需扣除空白值,保留两位有效数字。6精密度样品中T-2毒素的含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7其他本方法对粮食及粮食制品中T-2毒素的检出限为10μg/kg,定量限为33μg/kg;对酒类,酱油、醋、酱及酱制品中T-2毒素的检出限为5μg/kg,定量限为17μg/kg。第二法间接ELISA法8原理将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测试样(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色产物,通过酶标仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测试样中的抗原量。9试剂和原料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。9.1试剂9.1.1甲醇(CH3OH)。9.1.2石油醚(C7H7BrMg)。9.1.3三氯甲烷(CHCl3)。9.1.4无水乙醇(C2H5OH)。9.1.5乙酸乙酯(C4H8O2)。9.1.6二甲基甲酰胺(C3H7NO)。9.1.7四甲基联苯胺(TMB)。9.1.8吐温-20(C58H114O26)。9.1.930%过氧化氢(30%H2O2)。9.1.10碳酸钠(Na2CO3)。9.1.11碳酸氢钠(NaHCO3)。9.1.12磷酸二氢钾(KH2PO4)。GB5009.118—201659.1.13磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。9.1.14氯化钠(NaCl)。9.1.15氯化钾(KCl)。9.1.16柠檬酸(C6H8O7·H2O)。9.1.17抗体:杂交瘤细胞系产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。9.1.18抗原:T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)的结合物。9.1.19兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。9.2试剂配制9.2.1ELISA缓冲液系统。9.2.1.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,称取1.59g碳酸钠、2.93g碳酸氢钠,加水稀释至1000mL。9.2.1.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T)。配制方法为:称取0.2g磷酸二氢钾、2.9g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.5mL吐温-20,加水至1000mL。9.2.1.3底物缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液,配制方法为:0.1mol/L柠檬酸,即称取柠檬酸19.2g,加水至1000mL,为甲液;0.2mol/L磷酸氢二钠,即称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000mL,为乙液;取甲液24.3mL,乙液25.7mL,加水至100mL即可。9.2.1.4底物溶液:取50μLTMB溶液(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中),加10mL底物缓冲液及10μL30%过氧化氢,混匀。9.3标准品T-2毒素(C24H34O9,CAS号:21259-20-1),纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。9.4标准溶液配制9.4.1标准储备液:准确称取适量标准品(精确至0.0001g),用甲醇溶解,配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液,-18℃以下避光保存。9.4.2标准工作液:根据需要用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T,不加吐温-20即可)将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液。9.5材料9.5.1酶标板(48孔或96孔)。9.5.2具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。9.5.3层析柱:在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性氧化铝,敲平表面,再加入0.4g活性炭,敲紧。10仪器和设备注:所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡,用水冲洗。10.1酶标仪。10.2电动振荡器。10.3电热恒温水浴锅。10.4天平:感量为0.0001g和0.01g。GB5009.118—2016611分析步骤11.1提取称取20.0g粉碎并通过20目筛的试样,置200mL具塞锥形烧瓶中,加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(4∶1,体积比),密塞,振荡1h,滤纸过滤,取25mL滤液于蒸发皿中,置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣,洗入250mL分液漏斗中,再用20mL甲醇-水(4∶1)分次洗涤,转入同一分液漏斗中,振荡1.5min,静置约15min,收集下层甲醇-水提取液过层析柱净化。将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中,并于水浴锅上浓缩至干,趁热加3mL乙酸乙酯,加热至沸,挥干,再重复一次,最后加3mL乙酸乙酯,冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿,并入浓缩瓶中,将浓缩瓶置95℃水浴锅上,挥干冷却后,用含20%甲醇的PBS定容,供ELISA检测。11.2检测11.2.1用T-2-BSA(4μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜。11.2.2酶标板用PBS-T洗3次,每次3min后,加入不同浓度的标准工作液(制作标准曲线)或试样提取液(检测试样中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1∶1,体积比,每孔100μL,该混合液应于