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中华人民共和国国家标准GB5009.205—20132013-11-29发布2014-06-01实施食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定GB5009.205—2013I前言本标准代替GB/T5009.205—2007《食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》。本标准与GB/T5009.205—2007相比，主要变化如下：——增加了加速溶剂萃取（ASE）方法；——增加了WHO于2005年修订后的多氯代二苯并二噁英及呋喃和二噁英样多氯联苯毒性当量因子。GB5009.205—20131食品安全国家标准食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定1范围本标准规定了食品中17种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并二噁英（PCDDs）、多氯代二苯并呋喃（PCDFs）和12种二噁英样多氯联苯（DL-PCBs）含量及二噁英毒性当量（TEQ）的测定方法。本标准适用于附录A的表A.1中规定的食品中17种2,3,7,8-取代多氯代二苯并二噁英及多氯代二苯并呋喃（PCDD/Fs）和12种DL-PCBs含量及其TEQ的测定。2原理应用高分辨气相色谱－高分辨质谱联用技术，在质谱分辨率大于10000的条件下，通过精确质量测量监测目标化合物的两个离子，获得目标化合物的特异性响应。以目标化合物的同位素标记化合物为定量内标，采用稳定性同位素稀释法准确测定食品中2,3,7,8位氯取代的PCDD/Fs和DL-PCBs的含量；并以各目标化合物的毒性当量因子(TEF)与所测得的含量相乘后累加，得到样品中二噁英及其类似物的毒性当量（TEQ）。3试剂和材料3.1有机溶剂注：以下有机溶剂均为农残级，浓缩10000倍后不得检出二噁英及其类似物。3.1.1丙酮（C3H6O）。3.1.2正己烷（C6H14）。3.1.3甲苯（C7H8）。3.1.4环己烷（C6H12）。3.1.5二氯甲烷（CH2Cl2）。3.1.6乙醚（C4H10O）。3.1.7甲醇（CH3OH）。3.1.8正壬烷（C9H20）。3.1.9异辛烷（C8H18）。3.1.10乙酸乙酯（CH3COOCH2CH3）。3.1.11乙醇（CH3CH2OH）。3.2标准溶液3.2.1PCDD/Fs标准溶液注：本标准推荐使用EPA1613-1997规定的标准溶液，各实验室可根据具体情况选用相当的标准品。如果需要制备储备溶液，应该在通风橱中进行，并且戴上防毒面罩。GB5009.205—201323.2.1.1校正和时间窗口确定的标准溶液（CS3WT溶液）：用壬烷配制，为含有天然和同位素标记PCDD/Fs（定量内标、净化标准和回收率内标）的溶液，用于方法的校正和确证，并可以用于DB5MS毛细管柱(或等效柱)时间窗口确定和2,3,7,8-TCDD分离度的检查（见附录B的表B.1）。3.2.1.2净化标准溶液：用壬烷配制的37Cl4-2,3,7,8-TCDD溶液（浓度为40μg/L±2μg/L）。3.2.1.3同位素标记定量内标的储备溶液：用壬烷配制的13C12-PCDD/Fs溶液（见附录B的表B.2）。3.2.1.4回收率内标标准溶液：用壬烷配制的13C12-1,2,3,4-TCDD和13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD溶液（见附录B的表B.3）。3.2.1.5精密度和回收率检查标准溶液（PAR）：用壬烷配制的含天然PCDD/Fs溶液（见附录B的表B.4），用于方法建立时的初始精密度和回收率试验（IPR）及过程精密度和回收率试验（OPR）。3.2.1.6保留时间窗口确定的标准溶液(TDTFWD)：用于确定规定毛细管柱中四氯至八氯取代化合物出峰顺序，同时用于检查在规定的色谱柱中2,3,7,8-TCDD和2,3,7,8-TCDF的分离度（见附录B的表B.6）。3.2.1.7校正标准溶液：为含有天然和同位素标记的PCDD/Fs系列校正溶液（见附录B的表B.7），其中CSL为浓度更低的天然PCDD/Fs校正溶液，用于质谱系统校正。测定校正标准溶液，可以获得天然与标记PCDD/Fs的相对响应因子（RRF）。此外，CS3用于已建立RRF的日常校正和校正曲线校验(VER)；CS1用于检查HRGC-HRMS必须具备的灵敏度。由于食品要求的灵敏度更低，可以使用CSL进行灵敏度检查。3.2.2DL-PCBs标准溶液注：本标准推荐使用EPA1668A规定的标准溶液，各实验室可根据具体情况选用相当的标准品。如果需要制备储备溶液，应该在通风橱中进行，并且戴上防毒面罩。3.2.2.1时间窗口确定和定量内标标准溶液：用壬烷配制的含同位素标记DL-PCBs的溶液（见附录B的表B.8）。3.2.2.2同位素标记的净化内标标准溶液：用壬烷配制含13C12-2,4,4'-TrPCB、13C12-2,3,3',5,5'-PePCB和13C12-2,2',3,3',5,5',6-HPCB溶液（见附录B的表B.9）。3.2.2.3同位素标记的回收率内标标准溶液：用壬烷配制含13C12-2,2',5,5'-TePCB、13C12-2,2',4',5,5'-PePCB、13C12-2,2',3',4,4',5'-HxPCB和13C12-2,2',3,3',4,4',5,5'-OctaPCB溶液（见附录B的表B.10）。3.2.2.4精密度和回收率检查标准溶液(PAR)：用壬烷配制的含天然DL-PCBs溶液（见附录B的表B.11），用于方法建立时的初始精密度和回收率试验（IPR）及过程精密度和回收率试验（OPR）。3.2.2.5校正标准溶液：为含有天然（目标化合物）和同位素标记（定量内标、净化标准和回收率内标）的DL-PCBs系列校正溶液（见附录B的表B.12）。其中CS3用于已建立RRF的日常校正和校正曲线校验(VER)，CS1用于检查HRGC-HRMS必须具备的灵敏度。3.2.2.6高灵敏度检查的标准溶液：为天然DL-PCBs的溶液（浓度0.2μg/L，见附录B的表B.13）。3.2.2.7校正检查的标准溶液：浓度相当于CS3，不含同位素标记，仅为天然DL-PCBs的溶液（50μg/L，见附录B的表B.14）。3.3样品净化用吸附剂注：样品净化用吸附剂应在制备后尽快使用，如果经过一段较长时间的保存，应检验其活性。在装有氧化铝和硅胶等容器上应标识其制备日期或开封日期。如果标识不可辨认，应废弃吸附剂，重新制备。由于存在PCBs污染问题，有时适合于PCDD/Fs测定的试剂不一定适合DL-PCBs的测定，应该经过检查证实没有干扰后使用。3.3.1氧化铝注：如果内标化合物的回收率能达到要求，则可在酸性氧化铝或碱性氧化铝中选择一种用于样品提取液净化。但所有样品，包括初始精确度和回收率检查试验，均应使用同样类型的氧化铝。3.3.1.1酸性氧化铝：在130°C下至少加热活化12h。GB5009.205—201333.3.1.2碱性氧化铝：在600°C下至少加热活化24h。加热温度不能超过700℃，否则其吸附能力降低。活化后保存在130℃的密闭烧瓶中。应在烘烤后五天内使用。3.3.2硅胶3.3.2.1规格：75μm~250μm或相当等级的硅胶。3.3.2.2活性硅胶：使用前，取硅胶分别用甲醇、二氯甲烷清洗，在180℃下至少烘烤1h或150℃下至少烘烤4h（最多6h）。在干燥器中冷却，保存在带螺帽密封的玻璃瓶中。3.3.2.3酸化硅胶（44%，质量分数）：称取56g活性硅胶置于250mL具塞磨口旋转烧瓶中，在玻璃棒搅拌下加入44g硫酸，将烧瓶用旋转蒸发器旋转1h～2h，使之混和均匀无结块，置干燥器内，可保存3周。3.3.2.4碱化硅胶（33%，质量分数）：称取100g活性硅胶置于250mL具塞磨口旋转烧瓶中，在玻璃棒搅拌下逐滴加入49gNaOH溶液（1mol/L），将烧瓶用旋转蒸发器中旋转1h～2h，使之混和均匀无结块。将碱化硅胶置干燥器内保存。3.3.2.5硝酸银硅胶：称取10g硝酸银置于100mL烧杯中，加水40mL溶解。将该溶液转移至250mL旋转烧瓶中，慢慢加入90g活性硅胶，在旋转蒸发器中旋转1h～2h，使之干燥并混和均匀。取出后，在干燥器中冷却，置于褐色玻璃瓶内保存。3.3.3弗罗里土3.3.3.1规格：150μm~250μm。使用前，称取500g，装入索氏提取器中，用适量正己烷:二氯甲烷（1:1，体积比）提取24h。3.3.3.2含水1%（质量分数）的弗罗里土：称取弗罗里土99.0g，加水1.0mL，搅拌均匀，用带聚氟乙烯螺帽的玻璃瓶封装。3.3.4混合活性炭称取9.0gCarbopakC（推荐使用Supelco1-0258，或其他相当的类型）和41.0gCelite545（推荐使用Supelco2-0199，或其他相当的类型），充分混和，含活性炭为18%（质量分数)。在130℃中至少活化6h，在干燥器中保存。3.4其他材料3.4.1无水硫酸钠（Na2SO4）：优级纯。3.4.2硫酸（H2SO4）：优级纯。3.4.3氢氧化钠（NaOH）：优级纯。3.4.4硝酸银（AgNO3）：优级纯。3.4.5草酸纳（Na2C2O4）：优级纯。3.4.6玻璃棉：使用前以二氯甲烷及正己烷回流48h，用氮气吹干后，置于棕色瓶内备用。3.4.7凝胶色谱填料：Bio-BeadsS-X3，38μm~75μm。3.4.8硅藻土（选用）：加速溶剂萃取用。3.5参考基质玉米油或其他植物油。基质中未检出PCDD/Fs和DL-PCBs为最理想的情况。由于环境中PCBs的广泛存在，植物油中可能存在背景水平的PCBs，作为基质时要求其背景水平不得超过附录C表C.1中的检测限的值。4仪器和设备4.1高分辨气相色谱-高分辨质谱仪(HRGC-HRMS)。GB5009.205—201344.2气相色谱柱，不同的目标物应选用不同的气相色谱柱：a)用于PCDD/Fs检测：DB-5ms（5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷）柱，60m×0.25mm×0.25μm或等效色谱柱；RTX-2330（90%双氰丙基-10%苯基氰丙基聚硅氧烷）,60m×0.25mm×0.1μm或等效色谱柱；b)用于DL-PCBs检测：DB-5ms柱，60m×0.25mm×0.25μm或等效色谱柱。4.3组织匀浆器。4.4绞肉机。4.5冻干机。4.6旋转蒸发器。4.7氮气浓缩器。4.8超声波清洗器。4.9振荡器。4.10索氏提取器。4.11天平：感量为0.1mg。4.12恒温干燥箱：用于烘烤和贮存吸附剂，能够在105℃~250℃范围内保持恒温（±5℃）。4.13玻璃层析柱：带聚四氟乙烯柱塞，150mm×8mm，300mm×15mm。4.14全自动样品净化系统（选用）：配备酸碱复合硅胶柱、氧化铝和活性炭净化柱。4.15凝胶色谱系统（GPC）（选用，手动或自动系统）：玻璃柱（内径15mm～20mm），内装50gS-X3凝胶。4.16高效液相色谱仪（HPLC）（选用）：包括泵、自动进样器、六通转换阀、检测器和馏分收集器，配备Hypercarb（100mm×4.6mm，5μm）或相当色谱柱。4.17加速溶剂萃取仪（选用）。5试样制备与净化5.1样品采集与保存5.1.1现场采集的样品用避光材料如铝箔、棕色玻璃瓶等包装，置冷冻箱中运输到实验室，–10℃以下低温保存。5.1.2液体或固体样品，如鱼、肉、蛋、奶等经过匀浆使其匀质化后可使用冷冻干燥或无水硫酸钠干燥，混匀。油脂类样品可直接用正己烷溶解后进行净化分离。5.2试样制备5.2.1溶剂和提取液的旋转蒸发浓缩5.2.1.1连接旋转蒸发器，将水浴锅预热至45℃。在试验开始前，预先将100mL正己烷:二氯甲烷（1:1，体积比）作为提取溶剂浓缩，以清洗整个旋转蒸发仪系统。如有必要，对经浓缩后的溶剂以及收集瓶中的溶剂进行检验，以便对污染状况进行检查。在两个浓缩样品之间，分三次用2mL～3mL溶剂洗涤旋转蒸发仪接口，用烧杯收集废液。5.2.1.2将装有样品提取液的茄形瓶连接到旋转蒸发器上，缓慢抽真空。5.2.1.3将茄形瓶降至水浴锅中，调节转速和水浴的温度（或真空度），使浓缩在15min～20min内完成。在正确