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书书书!#$%&’’()*犌犅５００９．２０８—２０１６!#$%&’(!)*+,-./２０１６１２２３01２０１７０６２３23!#$%&’’(+,&-.,/012’(34546789:;01书书书前 言 本标准代替ＧＢ／Ｔ５００９．２０８—２００８《食品中生物胺含量的测定》、ＧＢ／Ｔ２０７６８—２００６《鱼和虾中有毒生物胺的测定 液相色谱紫外检测法》、ＳＮ／Ｔ２２０９—２００８《进出口水产品中有毒生物胺的检测方法 高效液相色谱法》，及ＧＢ／Ｔ５００９．４５—２００３《水产品卫生标准的分析方法》中组胺检测部分。本标准与ＧＢ／Ｔ５００９．２０８—２００８相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中生物胺的测定”；———增加了分光光度法；———增加了章鱼胺；———修改了酒类和醋酱油的测定；———修改了流动相和洗脱梯度；———修改了样品前处理方法；———适用范围删除了乳制品。Ⅰ犌犅５００９．２０８—２０１６食品安全国家标准食品中生物胺的测定第一法 液相色谱法１ 范围本标准规定了食品中色胺、β苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺含量的测定方法。本标准适用于酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）、水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类中生物胺的测定。２ 原理水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类：试样用５％三氯乙酸提取，正已烷去除脂肪，三氯甲烷正丁醇（１＋１）液液萃取净化后，丹磺酰氯衍生，Ｃ１８色谱柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，内标法定量。酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）：试样用丹磺酰氯衍生，Ｃ１８色谱柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，内标法定量。３ 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１ 试剂３．１．１ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。３．１．２ 丙酮（Ｃ３Ｈ６Ｏ）：色谱纯。３．１．３ 乙醚（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）：重蒸。３．１．４ 正丁醇（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）。３．１．５ 三氯甲烷（ＣＨＣｌ３）。３．１．６ 正已烷（Ｃ６Ｈ１４）：色谱纯。３．１．７ 乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）：色谱纯。３．１．８ 乙酸铵（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）：色谱纯。３．１．９ 谷氨酸钠（Ｃ５Ｈ８ＮＮａＯ４）。３．１．１０ 碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）。３．１．１１ 氯化钠（ＮａＣｌ）。３．１．１２ 氢氧化钠（ＮａＯＨ）。３．１．１３ 盐酸（ＨＣｌ，３７％）。３．１．１４ 三氯乙酸（Ｃ２ＨＣｌ３Ｏ２）。１犌犅５００９．２０８—２０１６３．１．１５ 丹磺酰氯（Ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ１２Ｈ１２ＣｌＮＯ２Ｓ，ＣＡＳ号：６０５６５２，纯度＞９９％）。３．２ 试剂配制３．２．１ 丹磺酰氯衍生剂溶液：准确称取丹磺酰氯适量，以丙酮为溶剂配制浓度为１０ｍｇ／ｍＬ的衍生剂使用液，置４℃冰箱避光储存。３．２．２ ５％三氯乙酸溶液：准确称取２５ｇ三氯乙酸于２５０ｍＬ烧杯中，用适量水完全溶解后转移至５００ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。３．２．３ １ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液：准确量取８．６ｍＬ盐酸于１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。３．２．４ ０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液：准确量取１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液１０ｍＬ于１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。３．２．５ １ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取４ｇ氢氧化钠，加入１００ｍＬ水完全溶解。３．２．６ 正丁醇／三氯甲烷（１＋１）混合溶液：分别量取相同体积的正丁醇和三氯甲烷混合均匀即可。３．２．７ 饱和碳酸氢钠溶液：称取１５ｇ碳酸氢钠，加入１００ｍＬ水溶解，取上清液即为饱和溶液。３．２．８ ５０ｍｇ／ｍＬ谷氨酸钠溶液：准确称取５．０ｇ谷氨酸钠用饱和碳酸氢钠溶液溶解并定容至１００ｍＬ。３．２．９ 含１％乙酸的０．０１ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液：称取０．７７ｇ乙酸铵溶解于水中，转移至１０００ｍＬ容量瓶中，加入１０ｍＬ乙酸，用水定容至刻度。３．２．１０ 流动相Ａ：量取１００ｍＬ含１％乙酸的０．０１ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液加入９００ｍＬ乙腈。３．２．１１ 流动相Ｂ：量取９００ｍＬ含１％乙酸的０．０１ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液于加入１００ｍＬ乙腈。３．３ 标准品３．３．１ 组胺盐酸盐（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ５Ｈ９Ｎ３·２ＨＣｌ，ＣＡＳ号：５６９２８）标准品（纯度＞９９％）。３．３．２ β苯乙胺盐酸盐（βｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ８Ｈ１１Ｎ·ＨＣｌ，ＣＡＳ号：６４０４０）标准品（纯度＞９８％）。３．３．３ 酪胺盐酸盐（Ｔｙｒａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ８Ｈ１１ＮＯ·ＨＣｌ，ＣＡＳ号：６０１９５）标准品（纯度＞９８％）。３．３．４ 腐胺盐酸盐（Ｐｕｔｒｅｓｅｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ４Ｈ１２Ｎ２·２ＨＣｌ，ＣＡＳ号：３３３９３７）标准品（纯度＞９８％）。３．３．５ 尸胺盐酸盐（Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ５Ｈ１４Ｎ２·２ＨＣｌ，ＣＡＳ号：１４７６３９７）标准品（纯度＞９８％）。３．３．６ 色胺盐酸盐（Ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２·ＨＣｌ，ＣＡＳ号：６１５４１）标准品（纯度＞９９％）。３．３．７ 精胺盐酸盐（Ｓｐｅｒｍｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ１０Ｈ２６Ｎ４·４ＨＣｌ，ＣＡＳ号：３０６６７２）标准品（纯度＞９７％）。３．３．８ 亚精胺盐酸盐（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ７Ｈ１９Ｎ３·３ＨＣｌ，ＣＡＳ号：３３４５０９）标准品（纯度＞９７％）。３．３．９ 章鱼胺盐酸盐（Ｏｃｔｏｐａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃ８Ｈ１１ＮＯ２·ＨＣｌ，ＣＡＳ号：７７００５９）标准品（纯度＞９７％）。３．３．１０ １，７二氨基庚烷（１，７Ｄｉａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｅ，Ｃ７Ｈ１８Ｎ２，ＣＡＳ号：６４６１９５）内标标准品（纯度＞９８％）。３．４ 标准溶液配制注：标准溶液的配制浓度以各生物胺单体计算，称取标准品时应对其中的盐酸盐进行折算。所有标准溶液配制好２犌犅５００９．２０８—２０１６后均需转移至密闭棕色容器中，避光贮存。３．４．１ 生物胺标准储备溶液的配制：准确称取各种生物胺标准品适量，分别置于１０ｍＬ小烧杯中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液溶解后转移至１０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，混匀，配制成浓度为１０００ｍｇ／Ｌ（以各种生物胺单体计）的标准储备溶液，置－２０℃冰箱储存。保存期为６个月。３．４．２ 生物胺标准混合使用液的配制：分别吸取１．０ｍＬ各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个１０ｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸稀释至刻度，混匀，配制成生物胺标准混合使用液（１００ｍｇ／Ｌ）。保存期为３个月。３．４．３ 生物胺标准系列溶液的配制：分别吸取０．１０ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．０ｍＬ、１．５０ｍＬ、２．５０ｍＬ、５．０ｍＬ生物胺标准混合使用液（１００ｍｇ／Ｌ），置于１０ｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使浓度分别为１．０ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、５０．０ｍｇ／Ｌ，临用现配。３．４．４ 内标标准储备溶液的配制：准确称取内标标准品适量，置于１０ｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液溶解后稀释至刻度，混匀，配制成浓度为１０ｍｇ／ｍＬ的内标标准储备溶液，置－２０℃冰箱储存。保存期为６个月。３．４．５ 内标标准中间使用液的配制：吸取１．０ｍＬ内标标准储备溶液于１０ｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸稀释至刻度，混匀，作为内标使用液（１．０ｍｇ／ｍＬ），存期为３个月。３．４．６ 内标标准使用液的配制：吸取１．０ｍＬ内标标准中间使用液于１０ｍＬ容量瓶中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸稀释至刻度，混匀，作为内标使用液（１００ｍｇ／Ｌ），临用现配。４ 仪器和设备４．１ 高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ），配有紫外检测器或二极管阵列检测器。４．２ 组织匀质仪。４．３ 离心机：转速≥６５００ｒ／ｍｉｎ。４．４ 涡旋振荡器。４．５ 水浴装置。４．６ 氮气浓缩装置。４．７ 天平：感量分别为０．０１ｇ和０．０００１ｇ。４．８ 酸度计：±０．１ｐＨ。４．９ 超纯水器。４．１０ 滤膜针头滤器：０．２２μｍ。５ 分析步骤５．１ 水产品和肉类５．１．１ 试样制备取水产品及肉类样品的可食部分约５００ｇ，充分匀质，均分成两份装入洁净容器中，密封，于－２０℃保存。５．１．２ 提取准确称取已经绞碎或匀浆后的水产品、肉类１０ｇ（精确至０．０１ｇ），置于１００ｍＬ具塞锥形瓶中，加入５００μＬ内标使用液（１．０ｍｇ／ｍＬ）与样品充分混匀，加入２０ｍＬ５％三氯乙酸溶液和振荡提取３０ｍｉｎ，转移至５０ｍＬ具塞离心管中，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移上清液至５０ｍＬ容量瓶中，残渣用２０ｍＬ３犌犅５００９．２０８—２０１６５％三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用５％三氯乙酸稀释至刻度，待净化。５．１．３ 净化５．１．３．１ 除脂肪：移取上述试样提取液１０ｍＬ于２５ｍＬ具塞试管中，加入０．５ｇ氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入１０ｍＬ正己烷，涡旋振荡５ｍｉｎ，静置分层后弃去上层有机相，下层试样溶液加入１０ｍＬ正己烷再除脂一次。５．１．３．２ 萃取：移取５ｍＬ上述除脂肪后的试样溶液于１０ｍＬ具塞离心管中，用５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液（几滴）调节ｐＨ至１２．０左右。加入５ｍＬ的正丁醇／三氯甲烷（１＋１）混合溶液，涡旋振荡５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取出，静置分层后，转移上层水相于另一个１０ｍＬ具塞离心管中，再萃取一次，合并萃取液，用正丁醇／三氯甲烷（１＋１）稀释至刻度。取５ｍＬ萃取液加入２００μＬ盐酸（１ｍｏｌ／Ｌ），混匀后４０℃水浴下氮气吹干，加入１ｍＬ盐酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ）涡旋振荡，使残留物完全溶解，待衍生。５．１．４ 衍生５．１．４．１ 试样的衍生：在上述待衍生的试样溶液中依次加入１ｍＬ饱和碳酸氢钠溶液、１００μＬ氢氧化钠溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、１ｍＬ衍生试剂，涡旋混匀１ｍｉｎ后置于６０℃恒温水浴中衍生１５ｍｉｎ，取出，分加入１００μＬ谷氨酸钠溶液，振荡混匀，６０℃恒温反应１５ｍｉｎ。取出，冷却至室温，于每个离心管中加入１ｍＬ水，涡旋混合１ｍｉｎ，４０℃水浴下氮吹除去丙酮（约１ｍＬ），加入０．５ｇ氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入５ｍＬ乙醚，涡旋振荡２ｍｉｎ，静置分层后，吸出上层有机相（乙醚层），再萃取一次，合并乙醚萃取液，４０℃水浴下氮气吹干。加入１ｍＬ乙腈涡旋振荡使残留物完全溶解，０．２２μｍ滤膜针头滤器过滤于进样小瓶，待测定。５．１．４．２ 标准的衍生：分别移取１ｍＬ生物胺标准系列溶液，置于１０ｍＬ具塞试管中，依次加入２５０μＬ内标使用液（１００ｍｇ／Ｌ），以下操作同试样的衍生步骤。５．２ 酒类及调味品（醋和酱油）５．２．１ 试样的衍生：准确量取１．０ｍＬ样品于１５ｍＬ塑料离心管中，依次加入２５０μＬ内标溶液（１００ｍｇ／Ｌ）、１ｍＬ饱和碳酸氢钠溶液、１００μＬ氢氧化钠溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、１ｍＬ衍生试剂，涡旋混匀１ｍｉｎ后置于６０℃恒温水浴锅中衍生１５ｍｉｎ，取出，分别加入１００μＬ谷氨酸钠溶液，振荡混匀，６０℃恒温反应１５ｍｉｎ，取出冷却至室温，于每个离心管中加入１ｍＬ超纯水，涡旋混合１ｍｉｎ，４０℃水浴下氮吹除去丙酮（约１ｍＬ），加入０．５ｇ氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再加入５ｍＬ乙醚，涡旋振荡２ｍｉｎ，静置分层后，转移上层有机相（乙醚层）于１５ｍＬ离心管中，水相（下层）再萃取一次，合并两次乙醚萃取液，４０℃水浴下氮气吹干。加入１ｍＬ乙腈振荡混匀，使残留物溶解，０．２２μｍ滤膜针头滤器过滤，待测定。５．２．２ 标准的衍生：同５．１．４．２。５．３ 液相色谱参考条件色谱柱为Ｃ１８柱（柱长２５０ｍｍ，柱内径４．６ｍｍ，柱填料粒径５μｍ），紫外检测波长２５４