GB 5009.209-2016 食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.209—2016食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.209—20161前言本标准代替GB/T5009.209—2008《谷物中玉米赤霉烯酮的测定》、GB/T23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T1745—2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》、SN/T1772—2006《进出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱-液相色谱法》,代替GB/T21982—2008《动物源食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》中玉米赤霉烯酮的检测方法。本标准与GB/T5009.209—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定”;———增加了适用范围;———增加了荧光光度法作为第二法;———增加了固相萃取柱净化液相色谱-质谱法作为第三法。GB5009.209—20162食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定1范围本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮的测定方法。本标准第一法适用于粮食和粮食制品,酒类,酱油、醋、酱及酱制品,大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定,第二法适用于大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定,第三法适用于牛肉、猪肉、牛肝、牛奶、鸡蛋中玉米赤霉烯酮的测定。第一法液相色谱法2原理用乙腈溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮,经免疫亲和柱净化后,用高效液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.3氯化钠(NaCl)。3.1.4氯化钾(KCl)。3.1.5磷酸氢二钠(Na2HPO4)。3.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.7吐温-20(C58H114O26)。3.1.8盐酸(HCl)。3.2试剂配制3.2.1提取液:乙腈-水(9+1)。3.2.2PBS清洗缓冲液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用990mL水将上述试剂溶解,用盐酸调节pH至7.0,用水定容至1L。3.2.3PBS/吐温-20缓冲液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用900mL水将上述试剂溶解,用盐酸调节pH至7.0,加入1mL吐温-20,用水定容至1L。3.3标准品玉米赤霉烯酮(C18H22O5,CAS号:17924-92-4),纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证GB5009.209—20163书的标准物质。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备液:准确称取适量的标准品(精确至0.0001g),用乙腈溶解,配制成浓度为100μg/mL的标准储备液,-18℃以下避光保存。3.4.2系列标准工作液:根据需要准确吸取适量标准储备液,用流动相稀释,配制成10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的系列标准工作液,4℃避光保存。3.5材料3.5.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱:柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng,或等效柱。3.5.2玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm,无荧光特性。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪:配有荧光检测器。4.2高速粉碎机:转速≥12000r/min。4.3均质器:转速≥12000r/min。4.4高速均质器:转速18000r/min~22000r/min。4.5氮吹仪。4.6空气压力泵。4.7玻璃注射器:10mL。4.8天平:感量0.0001g和0.01g。5分析步骤5.1提取5.1.1粮食和粮食制品称取40.0g粉碎试样(精确到0.1g)于均质杯中,加入4g氯化钠和100mL提取液,以均质器(4.3)高速搅拌提取2min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.1.2酱油、醋、酱及酱制品称取25.0g(精确到0.1g)混匀的试样,用乙腈定容至100.0mL,超声提取2min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.1.3大豆、油菜籽、食用植物油准确称取试样40.0g(准确到0.1g)(大豆需要磨细且粒度≤2mm)于均质杯中,加入4.0g氯化钠和100mL提取液,以高速均质器(4.4)高速搅拌提取1min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.1.4酒类取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或其他GB5009.209—20164不含二氧化碳的酒类试样20.0g(精确到0.1g)于50mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,摇匀。移取10.0mL滤液并加入40mL水稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。5.2净化5.2.1粮食和粮食制品将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL(相当于0.8g样品)5.1.1中的滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以1滴/s~2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至有部分空气进入亲和柱中。用5mL水淋洗柱子1次,流速为1滴/s~2滴/s,直至有部分空气进入亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.5mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中,于55℃以下氮气吹干后,用1.0mL流动相溶解残渣,供液相色谱测定。5.2.2酱油、醋、酱及酱制品,酒类将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL5.1.2或5.1.4中的滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力使溶液以1滴/s~2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至有部分空气进入亲和柱中。依次用10mLPBS清洗缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中,于55℃以下氮气吹干后,用1.0mL流动相溶解残渣,供液相色谱测定。5.2.3大豆、油菜籽、食用植物油将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL5.1.3中的滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力使溶液以1滴/s~2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至有部分空气进入亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.5mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s。收集洗脱液于干净的玻璃试管中,于55℃以下氮气吹干后,用1.0mL流动相溶解残渣,供液相色谱测定。5.3空白试验不称取试样,按5.1和5.2的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5.4测定5.4.1高效液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件如下:a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒度4μm,或等效柱;b)流动相:乙腈-水-甲醇(46∶46∶8,体积比);c)流速:1.0mL/min;d)检测波长:激发波长274nm,发射波长440nm;e)进样量:100μL;f)柱温:室温。5.4.2标准曲线的制作将系列玉米赤霉烯酮标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪,得到相应的峰面积。GB5009.209—20165以目标物质的浓度为横坐标,目标物质的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。5.4.3试样溶液的测定将待测试样溶液注入高效液相色谱仪,得到玉米赤霉烯酮的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。6分析结果的表述试样中玉米赤霉烯酮的含量按式(1)计算:X=ρ×V×1000m×1000×f…………………………(1)式中:X———试样中玉米赤霉烯酮的含量,单位为微克每千克(μg/kg);ρ———试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———试样测定液的最终定容体积,单位为毫升(mL);1000———单位换算常数;m———试样的称样量,单位为克(g);f———稀释倍数。计算结果需扣除空白值,保留两位有效数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他本方法对粮食和粮食制品中玉米赤霉烯酮的检出限为5μg/kg,定量限为17μg/kg。酒类中玉米赤霉烯酮的检出限为20μg/kg,定量限为66μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮的检出限为50μg/kg,定量限为165μg/kg。大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的检出限为10μg/kg,定量限33μg/kg。第二法荧光光度法9原理用乙腈溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮,经免疫亲和柱净化后,加入氯化铝溶液进行衍生。洗脱液通过荧光光度计测定。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一水。10.1试剂10.1.1乙腈(CH3CN):色谱纯。GB5009.209—2016610.1.2甲醇(CH3OH):色谱纯。10.1.3氯化钠(NaCl)。10.1.4磷酸氢二钠(Na2HPO4)。10.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。10.1.6氯化钾(KCl)。10.1.7吐温-20(C58H114O26)。10.1.8盐酸(HCl)。10.1.9硫酸(H2SO4)。10.1.10氯化铝(AlCl3·10H2O)。10.1.11硫酸奎宁(C20H24N2O2·H2SO4·2H2O)。10.2试剂配制10.2.1提取液:乙腈-水(9+1)。10.2.2PBS/吐温-20缓冲液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900mL水中,用盐酸调节pH至7.0,加入1mL吐温-20,用水稀释至1L。10.2.3氯化铝衍生溶液:称取2.5g氯化铝溶解于50mL甲醇中。10.2.4硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8mL硫酸,缓慢加入适量水中,冷却后定容至1000mL。10.2.5荧光光度计校准溶液:称取3.40g硫酸奎宁,用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL,此溶液的荧光光度计读数相当于0.45。10.3标准品玉米赤霉烯酮(C18H22O5,CAS号:17924-92-4),纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。10.4材料10.4.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱:柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng,或等效柱。10.4.2玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm,无荧光特性。11仪器和设备11.1荧光光度计。11.2高速均质器:18000r/min~22000r/min。11.3空气压力泵。11.4玻璃注射器:10mL。11.5天平:感量0.0001g和0.01g。12分析步骤12.1提取准确称取试样40.0g(精确至0.1g)(大豆需要磨细且粒度≤2mm)于均质杯中,加入4.0g氯化钠和100mL提取液(10.2.1),以高速均质器高速搅拌提取1min,定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液并加入40mLPBS/吐温-20缓冲液稀释混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。GB5009.209—2016712.2净化将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10.0mL滤液,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力使溶液以1滴/s~2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱,直至有部分空气进入亲和柱中。依次用10mLPBS/吐温-20缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL甲醇洗脱