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书书书!#$%&’’()*犌犅５００９．２５０—２０１６!#$%&’(!)*+,-./01２０１６０８３１23２０１７０３０１45!#$%&’’(+,&-.,/01223书书书犌犅５００９．２５０—２０１６Ⅰ 前 言 本标准代替ＧＢ／Ｔ２１９１７—２００８《饮料中乙基麦芽酚的测定方法》。本标准与ＧＢ／Ｔ２１９１７—２００８相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中乙基麦芽酚的测定”；———增加了标准的适用范围；———增加了不同类型食品试样的前处理方法；———修改了液相色谱条件；———增加了附录Ｂ质谱确证。犌犅５００９．２５０—２０１６１ 食品安全国家标准食品中乙基麦芽酚的测定１ 范围本标准规定了食品中乙基麦芽酚含量的高效液相色谱测定方法。本标准适用于饮料、糖果、果冻、肉制品、饼干、面包、糕点、乳粉食品中乙基麦芽酚含量的测定。２ 原理试样经提取、净化后，采用配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪检测，外标法定量；阳性样品需要采用质谱法进行定性确认。３ 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的二级水。３．１ 试剂３．１．１ 甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。３．１．２ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。３．１．３ 磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）。３．２ 磷酸二氢钠溶液配制称取３．９０ｇ磷酸二氢钠，加水溶解并稀释至近１０００ｍＬ，经磷酸调节ｐＨ至４．０±０．１，定容至１０００ｍＬ，经微孔滤膜过滤备用。３．３ 乙基麦芽酚（Ｃ７Ｈ８Ｏ３）标准品纯度不小于９９％。３．４ 标准溶液配制３．４．１ 标准储备液：称取乙基麦芽酚０．１ｇ（精确至０．０００１ｇ），用甲醇溶解，并定容至１００ｍＬ容量瓶中，此溶液浓度为１ｍｇ／ｍＬ。３．４．２ 标准系列工作液：分别准确吸取不同体积的标准储备液，用甲醇将其稀释成乙基麦芽酚含量分别为０．０μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、２５．０μｇ／ｍＬ、１００．０μｇ／ｍＬ的标准系列工作液。４ 仪器和设备４．１ 高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ）：配有二极管阵列检测器（ＤＡＤ）或紫外检测器（ＵＶＤ）。４．２ 超声波清洗器。犌犅５００９．２５０—２０１６２ ４．３ 涡旋混合仪。４．４ 水浴锅。４．５ 离心机：转速不低于６０００ｒ／ｍｉｎ。４．６ 分析天平：感量分别为０．０１ｇ、０．００１ｇ和０．０００１ｇ。５ 分析步骤５．１ 试样制备５．１．１ 碳酸饮料、果汁饮料、乳饮料、植物蛋白饮料试样准确称取１０ｇ试样（精确至０．０１ｇ）（碳酸饮料需先超声２ｍｉｎ～３ｍｉｎ以除去二氧化碳后取样）于２５ｍＬ具塞刻度试管中，用乙腈定容至刻度，混匀，超声１０ｍｉｎ（若样品溶液浑浊时，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ），取上清液，经微孔滤膜过滤，滤液进液相色谱仪分析。５．１．２ 糖果、果冻试样准确称取２ｇ试样（精确至０．００１ｇ）于２５ｍＬ具塞刻度试管中，加入２０ｍＬ水，置于６０℃～７０℃水浴锅中加热２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，加塞，剧烈振摇使其分散均匀，再置于６０℃～７０℃水浴锅中加热３０ｍｉｎ，取出后趁热超声５ｍｉｎ，冷却后用甲醇定容至刻度（奶糖用乙腈定容），６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，经微孔滤膜过滤，滤液进液相色谱仪分析。５．１．３ 肉制品、饼干、面包、糕点试样准确称取２ｇ粉碎均匀试样（精确至０．００１ｇ）至２５ｍＬ具塞刻度试管中，加入５ｍＬ水，加塞，涡旋１ｍｉｎ，使其分散均匀后，再加１５ｍＬ甲醇，加塞，摇匀，超声２０ｍｉｎ，用甲醇定容至刻度，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，微孔滤膜过滤，滤液进液相色谱仪分析。５．１．４ 乳粉试样准确称取２ｇ试样（精确至０．００１ｇ）至２５ｍＬ具塞刻度试管中，加入８ｍＬ水，加塞，涡旋１ｍｉｎ，使其充分溶解后，加１５ｍＬ乙腈，加塞，摇匀，超声２０ｍｉｎ，用乙腈定容至刻度，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，经微孔滤膜过滤，滤液进液相色谱仪分析。５．２ 仪器参考条件５．２．１ 色谱柱：Ｃ１８柱，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ，或性能相当者。５．２．２ 流动相：Ａ为甲醇；Ｂ为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱条件见表１。表１ 方法的梯度洗脱条件时间ｍｉｎＡ％Ｂ％０２５７５１６２５７５１６．１１０００２０１０００犌犅５００９．２５０—２０１６３ ５．２．３ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。５．２．４ 柱温：３０℃。５．２．５ 检测波长：２７６ｎｍ。５．２．６ 进样量：１０μＬ。５．３ 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的乙基麦芽酚的色谱峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。５．４ 试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的乙基麦芽酚的色谱峰面积，根据标准曲线得到待测液中乙基麦芽酚的浓度。乙基麦芽酚的标准液相色谱图参见图Ａ．１。５．５ 定性确认进行试样测定时，如果检出乙基麦芽酚的色谱峰的保留时间与标准品相一致，同时该物质的紫外吸收图谱与标准品的紫外吸收图谱相一致，则可初步确认试样中存在被测的乙基麦芽酚。阳性试样需用质谱仪进行确认试验（见附录Ｂ）。６ 分析结果的表述试样中乙基麦芽酚含量按式（１）计算：犡＝犮×犞×１０００犿×１０００…………………………（１） 式中：犡———试样中乙基麦芽酚的含量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犮———由标准曲线得出的样液中乙基麦芽酚的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———试样定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———试样质量，单位为克（ｇ）；１０００———换算系数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。７ 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。８ 其他当取样量为２ｇ时，糖果、果冻、肉制品、饼干、面包、糕点、乳粉等类食品的方法检出限为１．５ｍｇ／ｋｇ，定量限为５ｍｇ／ｋｇ；当取样量为１０ｇ时，饮料的方法检出限为０．６ｍｇ／ｋｇ，定量限为２ｍｇ／ｋｇ。犌犅５００９．２５０—２０１６４ 附 录 犃乙基麦芽酚的高效液相色谱图 乙基麦芽酚的高效液相色谱图见图Ａ．１。图犃．１ 乙基麦芽酚的高效液相色谱图犌犅５００９．２５０—２０１６５ 附 录 犅确证试验犅．１ 色谱条件色谱条件如下：ａ） 色谱柱：ＯＤＳＣ１８色谱柱，５０ｍｍ×２．１ｍｍ，１．８μｍ，或性能相当者。ｂ） 流动相：Ａ为甲醇；Ｂ为１０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵水溶液（含０．２％甲酸），梯度洗脱条件见表Ｂ．１。表犅．１ 方法的梯度洗脱条件时间ｍｉｎＡ％Ｂ％０２５７５２１０００１０１０００ ｃ） 流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。ｄ） 进样量：５μＬ。ｅ） 柱温：２５℃。犅．２ 质谱条件质谱条件如下：ａ） 电离方式：大气压化学电离，正离子模式。ｂ） 监测方式：多反应监测（ＭＲＭ）。ｃ） 雾化气压力：２７５．８ｋＰａ。ｄ） 干燥气温度：３２５℃。ｅ） 干燥气流速：８Ｌ／ｍｉｎ。ｆ） 汽化温度：３５０℃。ｇ） 定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量见表Ｂ．２。表犅．２ 乙基麦芽酚的定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量中文名称母离子犿／狕子离子犿／狕碎裂电压Ｖ碰撞能量ｅＶ乙基麦芽酚１４１．１１２６．１ａ；７１．１１２０１５／３０ ａ定量离子。犌犅５００９．２５０—２０１６６ 犅．３ 定性判定按照Ｂ．１和Ｂ．２的条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±２．５％之内）；试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度与标准溶液的相对丰度和浓度一致，相对丰度偏差不超过表Ｂ．３规定的范围，则可判定为试样中存在乙基麦芽酚。表犅．３ 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（犡）犡＞５０２０＜犡≤５０１０＜犡≤２０犡≤１０允许的最大偏差／％±２０±２５±３０±５０ 乙基麦芽酚标准溶液ＬＣＭＳ／ＭＳ多反应监测质量色谱图见图Ｂ．１。图犅．１ 乙基麦芽酚标准溶液犔犆犕犛／犕犛多反应监测质量色谱图