搜索
中华人民共和国国家标准GB5413.10—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminK1infoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproductsGB5413.10—2010I前言本标准等同采用国际分析家学会（AOAC）AOAC999.15VitaminKinMilkandInfantFormulasLiquidChromatographicMethod。本标准代替GB/T5413.10-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素K1的测定》。本标准与GB/T5413.10-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定》；——试样处理改为试样经酶水解后，用NaOH皂化，用正己烷萃取；——测定改为用高效液相色谱柱后还原荧光法定量测定维生素K1；——仪器中将“高压液相色谱仪带紫外检测器”修改为“高效液相色谱仪，带荧光检测器”。本标准附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.10-1997。GB5413.10—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理用脂肪酶降解试样中的脂肪和不饱和脂肪酸，对于含淀粉试样需先用淀粉酶降解试样中的淀粉，经碱皂化后，用正己烷提取维生素K1。通过液相色谱法分离，柱后还原维生素K1，荧光检测器检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1氢氧化钠溶液（10mol/L）：临用前配制。4.295%乙醇。4.3饱和氯化钠溶液。4.4正己烷：色谱纯。4.5无水硫酸钠。4.6甲醇：色谱纯。4.7二氯甲烷：色谱纯。4.8冰醋酸。4.9氯化锌。4.10无水乙酸钠。4.11流动相：甲醇（4.6）900mL，二氯甲烷（4.7）100mL，冰醋酸（4.8）0.3mL，氯化锌（4.9）1.5g，无水乙酸钠（4.10）0.5g，溶解后用0.45µm滤膜过滤。4.12淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。GB5413.10—201024.13脂肪酶：酶活力≥700U/mg。4.14锌粉：粒度50µm～70µm。4.15维生素K1标准溶液：标准溶液浓度校正方法参见附录A。4.15.1维生素K1标准储备液（2mg/mL）：称取0.05g维生素K1标准品（精确到0.1mg），于25mL容量瓶中，用正己烷溶解定容。4.15.2维生素K1标准中间液（20µg/mL）：取标准储备液（4.15.1）1mL加正己烷定容至100mL。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带有荧光检测器。5.2天平：感量为0.1mg。5.3分液漏斗：250mL。5.4旋转蒸发器。5.5恒温空气浴振荡器。5.6离心机：转速≥3000转/分钟。5.7氮吹仪。6分析步骤6.1试样处理6.1.1含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，加入0.5g淀粉酶（4.12），用30mL温水溶解。6.1.2不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，用30mL温水溶解。6.2测定液的制备向上述处理过的试样溶液中加入1g脂肪酶（4.13），于37℃±5℃恒温空气浴振荡器中振荡过夜，使其充分酶解。取出酶解好的试样，加入2mL氢氧化钠溶液（4.1），用50mL乙醇（4.2）将溶液转入250mL的分液漏斗中，充分混匀（必要时加少量饱和氯化钠溶液（4.3））。加入50mL正己烷（4.4）。充分振摇2min，静置分层。放出下层水相于另一个250mL分液漏斗中，留下有机相。向水相中再次加入50mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有机相两次。将有机相通过无水硫酸钠（4.5）脱水过滤到一个500mL的烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃±2℃下蒸发至近干。用正己烷（4.4）转移残留物到一个10mL试管中，置氮吹仪上于40℃±2℃下吹干，准确加入1mL正己烷（4.4），充分振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在0℃以下冷冻1h备用。6.3测定6.3.1色谱参考条件GB5413.10—20103色谱柱：C18色谱柱，150mm×4.6mm，5µm，或具同等性能的色谱柱；锌还原柱：4.6mm×50mm（参见附录B）；检测波长：激发波长为243nm，发射波长为430nm；流动相：甲醇（4.6）900mL，二氯甲烷（4.7）100mL，冰醋酸（4.8）0.3mL，氯化锌（4.9）1.5g，无水乙酸钠（4.10）0.5g，溶解后用0.45µm滤膜过滤；流速：1mL/min；进样量：10µL。6.3.2维生素K1标准曲线绘制分别准确吸取标准中间液（4.15.2）0.0mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL加正己烷定容至25mL，此标准系列工作液维生素K1浓度分别为0.00μg/mL，0.40μg/mL，0.80μg/mL，1.20μg/mL，1.60μg/mL，2.00μg/mL。将系列标准维生素K1工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。6.3.3测定液的测定将制备好的测定液（6.2）在暗处放至室温，于离心机中在3000转/分钟下离心5min，吸取上清液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高（标准色谱图参见附录C）。从标准曲线上查得试样溶液中维生素K1的浓度或通过回归方程计算出试样溶液中维生素K1的浓度（μg/mL）。7分析结果的表述试样中维生素K1的含量按式（1）计算：100×××=iiimnVCX…………………………………………………（1）式中：X——维生素K1的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；Ci——试样溶液的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Vi——试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；mi——试样的质量，单位为克（g）；n——样液稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他9.1由于维生素K1遇光易分解，整个操作应避光。9.2本标准检出限为1µg/100g。GB5413.10—20104附录A（资料性附录）标准溶液浓度校正方法标准溶液配制后需要对所配制的标准溶液进行校正，具体操作如下：维生素K1标准浓度的标定：取维生素K1标准工作溶液，按给定波长测定各维生素的吸光值，用比吸光系数计算出该维生素K1的浓度。测定条件见表A.1。表A.1维生素K1吸光值的测定条件标准比吸光系数%1cmE波长λ（nm）维生素K1422248浓度按式(2)计算：C1=1001×EA………………………………………………………………………(2)式中：C1——维生素K1浓度，单位为克每毫升（g/mL）；A——维生素K1的平均紫外吸光值；E——维生素K11%比色光系数。GB5413.10—20105附录B（资料性附录）锌还原柱填装方法将锌粉（4.14）密集装入还原柱（4.6mm×50mm，不锈钢材质）中。装柱时，应连续少量多次将锌粉装入柱中，边装边轻轻拍打，以使装入的锌粉紧密。GB5413.10—20106附录C（资料性附录）维生素K1液相色谱图C.1维生素K1液相色谱图维生素K1液相色谱图见图C.1。Fluorescence0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00140.00160.00分钟1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00维生素K1-8.196图C.1维生素K1液相色谱图