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中华人民共和国国家标准GB5413.11—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminB1infoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproductsGB5413.11—2010I前言本标准代替GB/T5413.11-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素B1的测定》。本标准与GB/T5413.11-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定》；——取消了原标准第一法（荧光分光光度法）；——对原标准的结构进行了修改；——外标法定量采用多点标准曲线法；——在结果计算时明确样品中维生素B1含量以硫胺素计；——增加附录A标样的液相色谱图。本标准附录A为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.11-1997。GB5413.11—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理样品在稀盐酸环境中恒温水解，酶解，样液用碱性铁氰化钾衍生，正丁醇（或异丁醇）萃取后，经C18反相色谱柱分离，用荧光检测器（Ex：375nm，Em：435nm）检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1正丁醇或异丁醇。4.2铁氰化钾。4.3氢氧化钠。4.4浓盐酸。4.5三水乙酸钠。4.6冰乙酸。4.7甲醇：色谱纯。4.8维生素B1标准品：硫胺素盐酸盐或硫胺素硝酸盐，纯度≥99%。4.9铁氰化钾溶液（20g/L）：称取2g铁氰化钾（4.2），用水溶解并定容至100mL。临用前配制。4.10氢氧化钠溶液（100g/L）：称取25g氢氧化钠（4.3），用水溶解并定容至250mL。4.11碱性铁氰化钾溶液：将5mL铁氰化钾溶液（4.9）与200mL氢氧化钠溶液（4.10）混合。临用前配制。4.12盐酸（0.1mol/L）：吸取9mL浓盐酸（4.4），溶于1000mL水中。4.13盐酸（0.01mol/L）：吸取0.1mol/L盐酸（4.12）50mL，用水稀释并定容至500mL。GB5413.11—201024.14乙酸钠溶液（0.05mol/L）：称取6.80g三水乙酸钠（4.5），加900mL水溶解，用冰乙酸（4.6）调pH值至4.0～5.0，定容至1000mL。经0.45μm微孔滤膜过滤。4.15乙酸钠溶液（2.0mol/L）：称取27.22g三水乙酸钠（4.5），用水溶解并定容至100mL。4.16混合酶溶液，称取2.345g木瓜蛋白酶（活力单位≥600U/g）、1.175g淀粉酶（活力单位≥4000U/g），用水溶解并定容至50mL。临用前配制。4.17标准溶液4.17.1维生素B1标准储备液（500μg/mL）：称取相当于硫胺素50mg（精确至0.1mg）的维生素B1标准品（4.8），用0.01mol/L盐酸（4.13）溶解并定容于100mL。置于0℃～4℃冰箱中，保存期为3个月。4.17.2维生素B1标准中间液：准确吸取2.00mL标准储备液（4.17.1），用水稀释并定容至100mL，此溶液中维生素B1浓度为10μg/mL。临用前配制。4.17.3维生素B1标准工作液：分别吸取维生素B1标准中间液（4.17.2）0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL，用水溶解并定容至100mL。该标准系列浓度分别为0μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.5μg/mL、1.00μg/mL。临用前配制。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带有荧光检测器。5.2高压灭菌锅。5.3离心机：转速≥4000转/分钟。5.4pH计：精度0.01。5.5组织捣碎机（转速在0转/分钟～12000转/分钟可调）。5.60.45μm微孔有机滤膜。5.7天平：感量为0.001g和0.0001g。6分析步骤6.1试样的处理6.1.1试液提取称取5g～10g（精确至0.01g）试样（如有必要，将试样放入捣碎机中捣碎；试样中含维生素B15μg以上）于100mL三角瓶中，加60mL0.1mol/L盐酸（4.12），充分摇匀，用棉花塞和牛皮纸封口，放入高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，待冷却至40℃以下后取出，轻摇数次；用2.0mol/L乙酸钠溶液（4.15）调pH值至4.0左右，加入2.0mL（可根据酶活力不同适当调整用量）混合酶液（4.16），摇匀后，置于37℃的培养箱中过夜；将酶解液转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，滤纸过滤，取滤液备用。6.1.2试液衍生化取上述滤液10.00mL于25mL具塞比色管中，加入5mL碱性铁氰化钾（4.11），充分混匀后，加10.00mL正丁醇（或异丁醇）（4.1），强烈振荡后静置约10min，充分分层，吸取正丁醇（或异丁醇）相（上层）于4000转/分钟～6000转/分钟离心5min，取上清液经有机微孔滤膜过滤（5.6），供进样用。GB5413.11—20103另取10.00mL标准工作液（4.17.3），与试液同步进行衍生化。注1：室温条件下衍生产物在4h内稳定。注2：6.1.1和6.1.2操作过程应在避免强光照射的环境下进行。6.2测定6.2.1色谱参考条件色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5μm，250mm×4.6mm）或相当者。流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液（4.14）—甲醇（4.7）=65+35。流速：1.00mL/min。检测波长：激发波长375nm，发射波长435nm。进样量：20μL。6.2.2标准曲线绘制将维生素B1标准系列工作液（4.17.3）衍生物依次按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱峰面积，色谱图参见附录A。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.2.3试液测定将试液衍生物按上述推荐色谱条件进样测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。7分析结果的表述试样中维生素B1的含量按式（1）计算：c×V×100X＝………………………………………………………（1）m×1000式中：X——试样中维生素B1的含量（以硫胺素计），单位为毫克每百克（mg/100g）；c——试液的进样浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他当取样量为10.00g时，本标准中方法定量限为0.05mg/100g。GB5413.11—20104附录A（资料性附录）维生素B1标准溶液的液相色谱图A.1维生素B1标准溶液的液相色谱图维生素B1标准溶液的液相色谱图见图A.1。图A.1维生素B1标准溶液的液相色谱图