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中华人民共和国国家标准GB5413.12—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminB2infoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproducts中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施GB5413.12—2010I前言本标准代替GB/T5413.12-1997《婴幼儿食品和乳粉维生素B2的测定》。本标准与GB/T5413.12-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定》。——取消了方法一荧光分光光度法；——对原标准的结构进行了修改；——混合酶液中增加了酸性磷酸酶，以解决添加核黄素磷酸盐作为维生素B2强化剂的样品测定；——样品处理方法中增加了“避免强光照射”的注意点；——外标法定量采用多点标准曲线法；——在结果计算时明确样品中维生素B2含量以核黄素计；——增加附录A标准溶液的液相色谱图。本标准附录A为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.12-1997。GB5413.12—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理试样在稀盐酸环境中恒温水解，酶解，经C18反相色谱柱分离，用荧光检测器（Ex：462nm，Em：522nm）检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1盐酸。4.2三水乙酸钠。4.3冰乙酸。4.4甲醇：色谱纯。4.5维生素B2（核黄素）标准品：纯度≥99%。4.6盐酸（1+1）：量取100mL盐酸（4.1）缓慢倒入100mL水中，混匀。4.7盐酸（0.1mol/L）：吸取9mL盐酸（4.1），溶于1000mL水中。4.8盐酸（0.01mol/L）：吸取0.1mol/L盐酸（4.7）50mL，用水稀释并定容至500mL。4.9乙酸钠溶液（0.05mol/L）：称取6.80g三水乙酸钠（4.2），加900mL水溶解，用冰乙酸调pH值至4.0～5.0，用水定容至1000mL。经0.45μm微孔滤膜过滤。4.10乙酸钠溶液（2.0mol/L）：称取27.22g三水乙酸钠（4.2），用水溶解并定容至100mL。4.11混合酶溶液：称取2.345g木瓜蛋白酶（活力单位≥600U/g）、1.175g淀粉酶（活力单位≥4000U/g）和1.000g酸性磷酸酶（活力单位≥4000U/g），用水定容至50mL。临用前配制。4.12标准溶液GB5413.12—201024.12.1维生素B2标准储备液（250μg/mL）：称取25mg（精确至0.1mg）维生素B2标准品（4.5），加入盐酸（4.6）2mL，超声溶解后，立即用水转移并定容至100mL。置于棕色玻璃容器中在0℃～4℃冰箱贮存，保存期为3个月。4.12.2维生素B2标准中间液：准确吸取4.00mL标准储备液（4.12.1），用水稀释并定容至100mL，此溶液中维生素B2浓度为10μg/mL。临用前配制。4.12.3维生素B2标准系列工作液：分别吸取维生素B2标准中间液（4.12.2）0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL，用水溶解并定容至100mL。该标准系列浓度分别为0.00μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL。临用前配制。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带有荧光检测器。5.2高压灭菌锅。5.3pH计：精度为0.01。5.4组织捣碎机。5.50.45μm微孔水相滤膜。5.6天平：感量1mg和0.1mg。6分析步骤6.1试样的处理称取5g～10g（精确至0.01g）试样（如有必要，将试样放入捣碎机中捣碎；试样中含维生素B25μg以上）于100mL三角瓶中，加60mL0.1mol/L盐酸（4.7），充分摇匀，用棉花塞和牛皮纸封口，放入高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，待冷却至40℃以下后取出，轻摇数次；用2.0mol/L乙酸钠溶液（4.10）调pH值至4.0左右，加入2.0mL混合酶溶液（4.11），摇匀后，置于37℃培养箱中过夜；将酶解液转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，用定量滤纸过滤，取滤液再经0.45μm滤膜（5.5）过滤，取滤液备用。注：操作过程应避免强光照射。6.2测定6.2.1参考色谱条件色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5μm，250mm×4.6mm）或同等性能的色谱柱。流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液（4.9）—甲醇（4.4）=65＋35。流速：1.0mL/min。检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm。进样量：20μL。6.2.2标准曲线绘制将维生素B2标准系列工作液（4.12.3）依次进行色谱测定（其标准样品色谱图参见附录A中图A.1），记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.2.3试液测定将试液进行色谱测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。GB5413.12—201036.2.4空白试验除不加试样外，按上述操作步骤进行。7分析结果的表述试样中维生素B2的含量按式（1）计算：c×V×100X＝………………………………………………………………（1）m×1000式中：X——试样中维生素B2的含量（以核黄素计），单位为毫克每百克（mg/100g）；c——试液的进样浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他本标准定量限为：当取样量为10.00g时，0.05mg/100g。GB5413.12—20104附录A（资料性附录）维生素B2标准溶液的液相色谱图A.1维生素B2标准溶液的液相色谱图维生素B2标准溶液的液相色谱图见图A.1。图A.1维生素B2标准溶液的液相色谱图