GB 5413.16-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定

中华人民共和国国家标准GB5413.16—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationoffolicacid(folateactivity)infoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproductsGB5413.16—2010I前言本标准代替GB/T5413.16-1997《婴幼儿配方食品和乳粉叶酸（叶酸盐活性）测定》。本标准与GB/T5413.16-1997相比，主要变化如下：——对磷酸盐缓冲液作了调整；——增加了米粉的处理方法；——增加了光密度法测定步骤。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.16-1997。GB5413.16—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理利用干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469对叶酸的特异性，在含有叶酸的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定叶酸的含量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。4.1鸡胰腺：称取100mg干燥的鸡胰腺，加20mL蒸馏水，搅拌15min，离心10min（3000转/分钟），取上清液，临用前配制。4.20.9%生理盐水：称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。每周准备一次。4.3磷酸盐缓冲液4.3.1磷酸盐缓冲液Ⅰ（0.05mol/L）：称取5.85g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，用1000mL水溶解。临用前按0.5g/100mL加入抗坏血酸。4.3.2磷酸盐缓冲液Ⅱ（用于谷物及谷物制品前处理）：称取14.2g磷酸氢二钠，用1000mL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液A（4.16）调pH至7.8±0.1。4.3.3磷酸盐缓冲液III（用于谷物及谷物制品测试）：称取14.2g磷酸氢二钠，用1000mL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液A（4.16）调pH至6.8±0.1。4.3.4磷酸盐缓冲液Ⅳ（0.1mol/L）（用于谷物及谷物制品标准溶液制备）：溶解13.61g磷酸二氢钾于水中稀释到1000mL。用氢氧化钾溶液（4.10）调pH至7.0±0.1。4.4叶酸标准品。4.5氨水（10.8%）。4.6甲苯（C7H8）。4.7抗坏血酸（C6H8O6）。4.8菌株：干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469。GB5413.16—201024.9培养基4.9.1乳酸杆菌琼脂培养基：胨化乳15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。4.9.2乳酸杆菌肉汤培养基：胨化乳15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。4.9.3叶酸测定用培养基：酪蛋白胨10g，葡萄糖40g，乙酸钠40g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，DL-色氨酸0.2g，L-天门冬氨酸0.6g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸腺嘌呤10mg，盐酸鸟嘌呤10mg，尿嘧啶10mg，黄嘌呤20mg，聚山梨糖0.1g，谷光甘肽5mg，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰15mg，核黄素1mg，p-氨基苯甲酸2mg，维生素B64mg，盐酸硫胺素400μg，泛酸钙800μg，烟酸800μg，生物素20μg，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.7±0.1（20℃～25℃）。注：市售商业化合成培养基效果更稳定。4.10氢氧化钾溶液（4mol/L）：称取224g氢氧化钾于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。4.11木瓜蛋白酶溶液：1g蛋白酶（活力≥6000U/mg，pH6.0±0.1，40℃）溶于100mL磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）中。临用前配制。4.12α-淀粉酶溶液：1gα-淀粉酶（1.5U/mg）溶于100mL磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）中。临用前配制。4.130.22μm灭菌滤膜。4.14标准溶液的制备4.14.1叶酸标准贮备液（500μg/mL）：称取55mg～56mg（精确至0.1mg）叶酸标准品（4.4），用50mL蒸馏水转入100mL容量瓶中，加2mL氨水（4.5）。溶液制备后，按式（1）计算溶液的体积，要求贮备液中叶酸盐的浓度为500μg/mL：贮备液体积（mL）=5001001000×××cm或简化为：贮备液体积（mL）=50cm×………………………………………………(1)式中：m——叶酸标准品的质量，单位为毫克（mg）；c——叶酸标准品的纯度，单位为克每百克（g/100g）。用水稀释溶液至刻度，用吸管加水至计算要求的体积，充分混合，放入棕色试剂瓶中2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为4个月。4.14.2叶酸标准中间液（50μg/mL）：吸取10mL叶酸标准贮备液（4.14.1）于100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为1个月。4.14.3叶酸标准工作液（0.05ng/mL，0.1ng/mL）：吸取1mL叶酸标准中间液（4.14.2）于100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，混合。再吸该液1mL于100mL棕色容量瓶中，定容，混合。从上液中分别吸取5mL于250mL和500mL棕色容量瓶中，用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）定容到刻度，混匀，即为高浓度标准工作液（0.1ng/mL）和低浓度标准工作液（0.05ng/mL）。临用前配制。4.15盐酸（1mol/L）：量取83.0mL盐酸溶于水中，冷却后定容至1000mL。GB5413.16—201034.16氢氧化钠溶液A（4mol/L）：称取160g氢氧化钠于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。4.17氢氧化钠溶液B（0.1mol/L）：吸取2.5mL氢氧化钠溶液A（4.16）转移至100mL容量瓶中用水定容。4.18氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L±0.0002mol/L）：称取4g（精确至0.0001g）氢氧化钠用水稀释至1000mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗入。4.18.1氢氧化钠标准溶液的标定：称取约0.18g（精确至0.0001g）于105℃～110℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，用50mL除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴5g/L的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。按式（2）计算氢氧化钠标准溶液的浓度：c=2042.0)(m21×−VV……………………………………………………(2)式中：c——氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m——称取的邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g）；V1——氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）；V2——空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）。4.18.2酚酞溶液：取0.5g酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，加入20mL水，再加入氢氧化钠溶液（4.18），直至加入一滴立即变成粉红色，再用水定容至100mL。4.19溴麝香草酚蓝指示剂：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加入1.6mL氢氧化钠溶液B（4.17）研磨，加少许水至完全溶解，转移至250mL容量瓶中用水定容。5仪器和设备5.1pH计：精度为0.01。5.2离心机：转速≥2000转/分钟。5.3分光光度仪。5.4天平：感量为0.1mg。5.5生化培养箱：36℃±1℃5.6滴定管：分刻度值为0.1mL。5.7涡旋振荡器。6分析步骤6.1测试菌液的制备6.1.1干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基（4.9.2）中，36℃±1℃培养24h后，转接至乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管中，再36℃±1℃培养24h。培养好的乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管的培养物作为贮备菌种。GB5413.16—201046.1.2从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管中，放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次，作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌株。6.1.3从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管，36℃±1℃培养24h，作为日接种管每日测定用。6.1.4从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基（4.9.2），36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min（2000转/分钟），弃去上清液。用10mL生理盐水（4.2）振荡洗涤菌体，离心10min（2000转/分钟），弃去上清液，用10mL生理盐水（4.2）振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（4.2），混匀。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水（4.2）中，混匀制成测试菌液。6.1.5以生理盐水（4.2）做对照，用分光光度计，于550nm波长下，测测试菌液（6.1.4）的光密度值，此值应在60%～80%之间。6.2试样的制备6.2.1乳制品称取2g（精确至0.0001g）试样（约含叶酸5μg）于100mL烧杯中，用25mL～30mL水复原样品，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中叶酸的质量浓度大约为0.05μg/mL。吸取1mL该样液和1mL鸡胰腺（4.1）于一个180mm×15mm的带螺旋盖的试管中，充分混合。加18mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1），再加1mL甲苯（4.6）。同时制备±空白对照管，吸1mL蒸馏水和1mL鸡胰腺（4.1）于空白管中，加18mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1）及1mL甲苯（4.6）。在37℃下，样品管和空白管保温16h后，于100℃水浴加热5min。用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）作适当稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大，则可以用1mL样液加19mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1）于100℃水浴加热5min，再用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。6.2.2谷物及谷物制品称取大约含1μg叶酸的试样于150mL三角烧瓶中。加20mLpH7.8磷酸缓冲溶液Ⅱ（4.3.2），混匀后加50mL水和1.0mL甲苯（4.6）。加盖后121℃15min灭菌，然后迅速冷却。加1mL木瓜蛋白酶溶液（4.11），于36℃±1℃保温3h后100℃加热3min，冷却。加1mLα-淀粉酶溶液（4.12），36℃±1℃保温2h后加4mL鸡胰腺（4.1），加盖，36℃±1℃保温16h后100℃加热3min，冷却。用1mol/L盐酸（4.15）调pH至4.5，用水稀释定容到100mL。过滤得到澄清滤液，然后吸取1mL澄清滤液用磷酸盐缓冲液III（4.3.3）定容至100mL，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大则可以直接在样品中加20mL0.05mol/L含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅱ（4.3.2