GB 5413.25-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定

中华人民共和国国家标准GB5413.25—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofinositolinfoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproductsGB5413.25—2010I前言本标准代替GB/T5413.25-1997《婴幼儿配方食品和乳粉肌醇的测定》。本标准与GB/T5413.25-1997相比，第一法主要变化如下：——对菌种保藏培养基进行了纠正；——试样处理由盐酸蒸馏法改为盐酸高压水解法；——菌种接种方式由菌液与培养基混合后分装试管改为菌液向试管中滴加法；——对标准工作溶液的浓度做了调整；——灭菌温度由100℃调整为121℃；——明确了控制接种菌悬液浓度的要求和方法；——提高了计算公式的适用性；——增加了检出限。第二法主要变化如下：——采用肌醇硅烷化衍生法；——增加了检出限。本标准的附录A和附录Ｂ为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.25-1997。GB5413.25—20101食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法微生物法3原理利用葡萄汁酵母菌（Saccharomycesuvarum）对肌醇的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。4.1菌株：葡萄汁酵母菌（Saccharomycesuvarum），ATCC9080。4.2肌醇（myo-Inositol）标准品：分子式C6H12O6，纯度≥99%。4.3氯化钠（NaCl）。4.4氢氧化钠（NaOH）。4.5培养基4.5.1麦芽浸粉琼脂培养基（MaltExtractAgar）：参见附录A。4.5.2肌醇测定培养基：参见附录A。4.6氯化钠溶液（9g/L）：称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装试管，每管10mL。121℃灭菌15min。4.7盐酸（1mol/L）：量取82.0mL盐酸溶于水中，冷却后定容至1000mL。4.8盐酸（0.44mol/L）：量取36.6mL盐酸溶于水中，冷却后定容至1000mL。4.9氢氧化钠溶液（600g/L）：称取300g氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至500mL。4.10氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至1000mL。GB5413.25—201024.11肌醇标准溶液4.11.1肌醇标准贮备液（0.2mg/mL）：肌醇标准品置于装有五氧化二磷的干燥器中干燥24h以上，称取50mg肌醇标准品（4.2）（精确到0.1mg），用水充分溶解，定容至250mL，贮存于冰箱中。4.11.2肌醇标准中间液（10µg/mL）：吸取5mL肌醇标准贮备液（4.11.1）用水定容到100mL，贮存于冰箱。4.11.3肌醇标准工作液（1µg/mL和2µg/mL）：吸取10mL肌醇标准中间液（4.11.2）两次，分别用水定容到100mL和50mL。该工作液需每次临用前配制。4.12干燥剂：五氧化二磷（P2O5）。4.13玻璃珠：直径约5mm。5仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1天平：感量为0.1mg。5.2pH计：精度≤0.02。5.3分光光度计。5.4涡旋混合器。5.5离心机：转速≥2000转/分钟。5.6恒温培养箱：30℃±1℃。5.7振荡培养箱：30℃±1℃，振荡速度140次/min～160次/min。5.8冰箱：2℃～5℃。5.9无菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器或吸头。5.10瓶口分液器：0mL～10mL。5.11锥形瓶：200mL。5.12容量瓶（A类）：100mL，250mL，500mL。5.13单刻度移液管（A类）：容量5mL。5.14漏斗：直径90mm。5.15定量滤纸：直径90mm。5.16试管：18mm×180mm。注：玻璃仪器使用前，用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在200℃干热2h。6分析步骤6.1接种菌悬液的制备GB5413.25—201036.1.1菌种复苏将菌株（4.1）活化后接种到麦芽浸粉琼脂斜面培养基（4.5.1）上，30±1℃℃培养16h～24h后，再转接2代～3代来增强活力，制成贮备菌种，贮于冰箱（8.5）中，保存期不要超过2周。临用前接种到新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上。6.1.2接种菌悬液的制备在使用的前一天将贮备菌种转接到新配制的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，于30℃±1℃培养16h～24h。用接种环刮取菌苔到一支灭菌氯化钠溶液（4.6）试管中。以2000转/分钟离心2min～3min，倾出上清液，加入10mL氯化钠溶液（4.6），振荡混匀，再离心2min～3min，如此清洗3次～4次。吸取一定量的该菌液移入装有10mL氯化钠溶液（4.6）的试管中，制成接种菌悬液。用分光光度计，以氯化钠溶液（4.6）作空白，550nm波长下测定该接种菌悬液的透光率，调整加入的菌液量或者加入一定量的氯化钠溶液使该菌悬液透光率在60%～80%。6.2试样的处理6.2.1称取约含肌醇0.5mg～2.0mg的试样（精确至0.1mg）于250mL三角瓶中，对于干粉试样加入80mL盐酸（4.8），对于液体试样加入100mL盐酸（4.8），混匀，使干粉试样溶解。6.2.2将三角瓶以铝箔纸覆盖，在灭菌釜中125℃消化1h。取出，冷却至室温，加入约2mL氢氧化钠溶液（4.9），冷却。用氢氧化钠溶液（4.10）或盐酸溶液（4.7）调pH至5.2，转入250mL容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤，收集滤液，该滤液为待测液。调整稀释度，使待测液肌醇的浓度在1µg/mL～10µg/mL范围内。6.3标准曲线的制作按表1顺序加入蒸馏水、肌醇标准工作液（4.11.3）和肌醇测定培养基（4.5.2）于培养管中，一式三份。表1标准曲线的制作试管号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10蒸馏水（mL）5543210210肌醇标准工作液1µg/mL（mL）0012345000肌醇标准工作液2µg/mL（mL）0000000345培养基（mL）55555555556.4待测液的制作按表2顺序加入蒸馏水、待测液（6.2.2）和肌醇测定培养基（4.5.2）于培养管中，一式三份。表2待测液的制作试管号1234蒸馏水（mL）4321待测液（mL）1234培养基（mL）55556.5灭菌GB5413.25—20104每支试管内加入一粒玻璃珠（4.13），盖上试管帽，121℃灭菌5min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。6.6接种将上述试管迅速冷却至30℃以下。用滴管或移液器向上述试管中各滴加一滴（约50µL）接种菌悬液（6.1.2），其中标准曲线管中的接种空白试管S1除外。6.7培养将试管固定在振荡培养箱内，用约140次/min～160次/min的振荡速度，在30℃±1℃振荡培养22h～24h。6.8测定对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则结果无效。6.8.1从振荡培养箱内取出试管，放入灭菌釜内，100℃保持5min，使微生物停止生长。6.8.2用接种空白试管S1（6.3）作空白，将分光光度计透光率调到100%（或吸光度A为0），读出接种空白试管S2（6.3）的读数。再以接种空白试管S2为空白，调节透光率为100%（或A为0），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度A）。6.8.3用涡旋混合器充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长为540nm～660nm，待读数稳定30s后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。以肌醇标准品的含量为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。6.8.4根据待测液的透光率，从标准曲线中查得该待测液中肌醇的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中肌醇的含量。透光率超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。6.8.5对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液肌醇的浓度，并计算该编号待测液的肌醇浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的,需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液肌醇含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx，用于计算试样中的肌醇含量。注：绘制标准曲线，既可读取透光率（T%），也可读取吸光度（A）。7分析结果的表述试样中肌醇的含量按式(1)计算：1001000××=fmCXx………………………………………………………………(1)式中：X——试样中肌醇的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；Cx——6.8.5中计算所得的总平均值，单位为微克（µg）；m——试样的质量，单位为克（g）；f——稀释倍数。婴幼儿食品和乳品f为250。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度GB5413.25—20105在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法气相色谱法9原理试样中的肌醇用水和乙醇提取后，与硅烷化试剂衍生，正己烷提取，经气相色谱分离，外标法定量。10试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1无水乙醇(C2H6O)。10.2正己烷(C6H14)。10.3乙醇（95%）。10.4乙醇（70%）。10.5三甲基氯硅烷(C3H9ClSi)。10.6六甲基二硅胺烷(C6H19NSi2)。10.7N，N-二甲基甲酰胺(C3H7NO)。10.8硅烷化试剂：分别吸取体积比为1：2：8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，超声混匀，临用前配制。10.9肌醇标准品：纯度≥99%。10.10肌醇标准溶液（0.010mg/mL）：称取100mg（精确至0.1mg）经过105±1℃℃烘干2h的肌醇标准品（10.9）于100mL容量瓶中，用25mL水溶解完全。用乙醇（10.3）定容至刻度，混匀。取1mL此溶液于100mL容量瓶中，用乙醇（10.4）定容至刻度，混匀。11仪器和设备11.1天平：感量为0.1mg。11.2气相色谱仪，带FID检测器。11.3离心机：转速≥5000转/分钟。11.4旋转蒸发仪。11.5超声波清洗器。11.6恒温热水浴槽。11.7带有罗纹盖的25mL试管。12分析步骤GB5413.25—2010612.1试样处理与衍生12.1.1试样处理：固体试样混合均匀后称取1g（精确至0.0001g），于50mL容量瓶中，加入12mL约40℃温水溶解试样；液体试样直接称取12g（精确至0.0001g）于50mL容量瓶中。上述试样超声提取约10min，用乙醇（10.3）定容至刻度，混匀。静置约20min后，取10mL于15mL离心管中，以不低于4000转/分钟离心约5min。取上清液5mL于旋转蒸发仪浓缩瓶中。12.1.2干燥与衍生：向浓缩瓶中加入10mL无水乙醇（10.1），在80℃±2℃下旋转浓缩至近干时再加入5mL无水乙醇（10.1）继续浓缩至彻底干燥（有水将使下步硅烷化不彻底）。加