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书书书中华人民共和国国家标准犌犅１５１９３．２３—２０１４食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验（报批稿）２０１４１２０１发布２０１５０５０１实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布书书书食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验１ 范围本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变。２ 术语和定义２．１ 染色体结构畸变通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和断片、染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）和染色单体型畸变（ｃｈｒｏｍａｔｉｄｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）。２．１．１ 染色体型畸变染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变。２．１．２ 染色单体型畸变染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。２．２ 有丝分裂指数中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是反映细胞增殖程度的指标。２．３ 核内复制在ＤＮＡ复制的Ｓ期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体有４、８、１６…倍的染色单体。２．４ 裂隙染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小错误排列。３ 试验目的和原理通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变，评价受试物致突变的可能性。在加入或不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。４ 仪器和试剂４．１ 仪器细胞培养箱，倒置显微镜，超净台，离心机。１犌犅１５１９３．２３—２０１４４．２ 培养液常用Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培养液（ｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ，ＭＥＭ），也可选用其他合适培养液。加入抗菌素（青霉素按１００ＩＵ／ｍＬ、链霉素１００μｇ／ｍＬ），将灭活的胎牛血清或小牛血清按１０％的比例加入培养液。４．３ 代谢活化系统４．３．１ 犛９辅助因子的配制４．３．１．１ 镁钾溶液氯化镁１．９ｇ和氯化钾６．１５ｇ加蒸馏水溶解至１００ｍＬ。４．３．１．２ ０．２犿狅犾／犔磷酸盐缓冲液（狆犎７．４）磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４，２８．４ｇ／Ｌ）４４０ｍＬ，磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ，２７．６ｇ／Ｌ）６０ｍＬ，调ｐＨ至７．４，０．１０３ＭＰａ２０ｍｉｎ灭菌或滤菌。４．３．１．３ 辅酶Ⅱ（氧化型）溶液无菌条件下称取辅酶Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成０．０２５ｍｏｌ／Ｌ溶液，现用现配。４．３．１．４ 葡萄糖６磷酸钠盐溶液称取葡萄糖６磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成０．０５ｍｏｌ／Ｌ，过滤灭菌。现用现配。４．３．２ 大鼠肝犛９组分的诱导和配制选健康雄性成年ＳＤ或Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１５０ｇ～２００ｇ，约５周龄～６周龄。将多氯联苯（Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４）溶于玉米油中，浓度为２００ｇ／Ｌ，按５００ｍｇ／ｋｇ体重无菌操作一次腹腔注射，５ｄ后处死动物，处死前禁食１２ｈ。也可采用苯巴比妥钠和β萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β萘黄酮，剂量均为８０ｍｇ／ｋｇ体重，连续３ｄ，禁食１６ｈ后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的０．１５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液３ｍＬ，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于４０００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ～２ｍｉｎ）或组织匀浆器（低于２００００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温（０℃～４℃）高速离心机上以９０００犵离心１０ｍｉｎ，吸出上清液为Ｓ９组分，分装于无菌冷冻管中，每管２ｍＬ左右，最好用液氮或干冰速冻后置－８０℃低温保存。Ｓ９组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Ｌｏｗｒｙ法），每毫升蛋白含量不超过４０ｍｇ为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于－８０℃低温或冰冻干燥，保存期不超过１年。４．３．３ １０％犛９混合液的制备一般由Ｓ９组分和辅助因子按１∶９组成１０％的Ｓ９混合液，无菌现用现配。１０％Ｓ９混合液１０ｍＬ配制如下：取上述磷酸盐缓冲液６．０ｍＬ、镁钾溶液０．４ｍＬ、葡萄糖６磷酸钠盐溶液１．０ｍＬ、辅酶Ⅱ溶液１．６ｍＬ、肝Ｓ９组分１．０ｍＬ，混匀，置冰浴中待用。Ｓ９混合液浓度一般为１％～１０％，实际使用浓度可由各实验室自行决定，但需对其活性进行鉴定，２犌犅１５１９３．２３—２０１４必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。４．４ 秋水仙素溶液用ＰＢＳ溶液配制适当浓度的储备液，过滤除菌，在避光冷藏的条件下至少能保存６个月。４．５ ０．０７５犿狅犾／犔氯化钾溶液５．５９ｇ氯化钾加蒸馏水至１０００ｍＬ。４．６ 固定液甲醇∶冰醋酸为３∶１，临用前配制。根据试验条件，可适当调整冰醋酸的浓度，改善染色体分散度，但不宜过大，导致细胞破裂。４．７ 姬姆萨（犌犻犲犿狊犪）染液取姬姆萨染料３．８ｇ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至３７５ｍＬ，待完全溶解后，再加１２５ｍＬ甘油，放入３７℃温箱中保温４８ｈ。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，２周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取１份姬姆萨染液原液，与９份１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）混合，配成其应用液，现配现用。磷酸盐缓冲液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．８）配制方法如下：ａ） 第一液：取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）９．４７ｇ溶于去离子水１０００ｍＬ中，配成１／１５ｍｏｌ／Ｌ溶液；ｂ） 第二液：取磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）９．０７ｇ溶于去离子水１０００ｍＬ中，配成１／１５ｍｏｌ／Ｌ溶液；ｃ） 取第一液５０ｍＬ加于第二液５０ｍＬ中混匀，即为ｐＨ６．８的１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液。５ 试验方法５．１ 受试物固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。５．２ 细胞株可选用中国仓鼠肺（ＣＨＬ）细胞株或卵巢（ＣＨＯ）细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）。试验前检查细胞的核型和染色体数目，检测细胞有无支原体污染。推荐使用中国仓鼠肺（ＣＨＬ）细胞株。５．３ 剂量５．３．１ 剂量设置受试物至少应取３个检测剂量。对有细胞毒性的受试物，其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性（细胞存活率在２０％～１００％的范围内）；通常浓度间隔系数不大于２～槡１０。５．３．２ 最高剂量的选择当收获细胞时，最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数（大于５０％，如毒性过大，应适当增加接种细胞数）；同时应该考虑受试物对溶解度、ｐＨ和摩尔渗透压浓度的影响；对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物，最高剂量应达到５μＬ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ或１０ｍｍｏｌ／Ｌ。３犌犅１５１９３．２３—２０１４对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。５．３．３ 细胞毒性的确定测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标，如相对集落形成率或相对细胞生长率等。应在Ｓ９系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。５．３．４ 阳性对照可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时，可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，ＭＭＳ）、甲磺酸乙酯（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，ＥＭＳ）、丝裂霉素Ｃ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎＣ）、乙基亚硝基脲（ｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ，ＥＮＵ）、硝基喹啉犖氧化物（４ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ犖ｏｘｉｄｅ）等。当存在外源性活化系统时，可使的阳性对照物有苯并［犪］芘［ｂｅｎｚｏ（犪）ｐｙｒｅｎｅ，ＢａＰ］、环磷酰胺（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）等。不加Ｓ９的阳性对照常用丝裂霉素Ｃ，其常用浓度为０．２μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬ。其ｐＨ为６～９的水溶液在０℃～５℃下避光保存能存放１周。加Ｓ９的阳性对照常用环磷酰胺，其常用浓度为８μｇ／ｍＬ～１５μｇ／ｍＬ。其水溶液不稳定，应现配现用。５．３．５ 阴性对照溶媒应为非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和Ｓ９活性。首选溶媒对照是不含血清的培养液和水，亦可使用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），但浓度不应大于０．５％。５．３．６ 空白对照如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。５．４ 试验步骤５．４．１ 细胞培养与染毒试验需在加入和不加入Ｓ９（Ｓ９的终浓度常为１％～１０％，以细胞毒性试验结果为准）的条件下进行。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中［以收获细胞时，培养皿（瓶）的细胞未长满为标准，一般以长到８５％左右为佳；如用ＣＨＬ细胞，可接种１×１０６个］，放ＣＯ２培养箱内培养。试验时吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、Ｓ９混合液（不加Ｓ９混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，置培养箱中处理２ｈ～６ｈ。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用ＰＢＳ溶液洗细胞３次，加入含１０％胎牛血清的培养液，放回培养箱，于２４ｈ收获细胞。于收获前２ｈ～４ｈ，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，终浓度为０．１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ）。当受试物为单一化学物质时，如果在上述加入和不加入Ｓ９混合液的条件下均获得阴性结果，则需加做长时间处理的试验，即在没有Ｓ９混合液的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至２４ｈ。当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。５．４．２ 收获细胞与制片５．４．２．１ 消化用０．２５％胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含１０％胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋４犌犅１５１９３．２３—２０１４白酶的作用，混匀，放入离心管以８００ｒ／ｍｉｎ～１０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎ，弃去上清液。５．４．２．２ 低渗加入０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液２ｍＬ，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入３７℃细胞培养箱中低渗处理３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ。５．４．２．３ 固定加入２ｍＬ固定液，混匀后固定５ｍｉｎ以上，以８００ｒ／ｍｉｎ～１０００ｒ／ｍｉｎ速度离心５ｍｉｎ，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。５．４．２．４ 滴片加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。５．４．２．５ 染色５％～１０％姬姆萨染液，１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。５．４．３ 阅片在油镜下阅片，每一剂量组应分析不少于１００个分散良好的中期分裂相，且每个观察细胞的染色体数在２狀±２范围之内。对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。５．５ 观察指标５．５．１ 染色体数目的改变５．５．１．１ 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。５．５．１．２ 多倍体：染色体成倍增加。５．５．１．３ 核内复制：核膜内的特殊形式的多倍化现象。５．５．２ 染色体结构的改变５．５．２．１ 断裂：损伤长度大于染色体的宽度。５．５．２．２ 微小体：较断片小而呈圆形。５．５．２．３ 有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。５．５．２．４ 无着丝点环：成环状结构。５．５．２．５ 单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。５．５．２．６ 双微小体：成对的染色质小体。５．５．２．７ 裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。５．５．２．８ 非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、黏着等。６ 数据处理和结果评价６．１ 数据处理 数据按不同剂量列表，指标包括观察