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酵母系列大实验设计PCR介导的酿酒酵母基因敲除1、实验目的学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因一步敲除法的原理，掌握酵母的转化方法，了解酵母生长及遗传学特性。2、实验原理酵母菌作为最简单的真核生物，能以单倍体和二倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以自由的在单倍体和二倍体之间进行转换，在生物学研究中有着得天独厚的优势。首先酵母菌生长速度很快。对数期生长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂一代，在合成培养基中140分钟分裂一代。其次，酵母的基因组很小，遗传背景相对简单，是一种很容易进行遗传操作的模式生物。酿酒酵母的基因组只有12052Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含子，其中有约5700个蛋白编码基因，分散在16条染色体上。上世纪90年代末，由数个实验室联合进行的酿酒酵母基因组敲除项目的完成是酵母遗传学研究的里程碑事件。在这个项目中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合子二倍体菌株库以及非必需基因的纯合子二倍体菌株库。这个项目几乎完成了全部ORF的敲除，为生物学研究，特别是组学研究，提供了十分强大的系统性研究工具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。此外，酵母作为真核生物，与高等生物在很多代谢通路和蛋白表达调节等方面是高度保守的，为高等生物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。目前，酿酒酵母已经具有一套十分灵活快速的遗传操作体系。酵母允许外源质粒以独立复制子游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。但跟其他生物相比，酵母比较独特且强大的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。之前提到的基因组敲除项目的完成就是依赖于高效率的同源重组，如图-1所示。人们利用PCR的方法，在筛选标记基因两侧引入待敲除基因（YFG，yourfavoritegene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源重组的作用下，一些细胞的对应基因位点的内源性序列被含有同源臂的外源序列直接取代，并通过选择培养基筛选出来。通过这个方法，我们可以对任意选定的染色体序列进行改变。图-1PCR介导的基因敲除原理本实验即是基于以上原理对实验菌株中的ADE2或ADE4基因进行敲除。ADE2及ADE4均编码酿酒酵母嘌呤核苷酸从头合成途径中重要的酶类，如图-2所示，ADE4位于ADE2的上游，编码5-磷酸核糖-1-焦磷酸盐酰胺转移酶（PRPPAT），催化该合成途径的第一步。ADE2则编码磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(AIR-carboxylase)，催化该合成途径的第六步。ADE2或ADE4基因的缺失突变会表现出腺嘌呤营养缺陷的表型，不能在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。除此之外，ADE2基因被突变失去功能时，还会有独特的表型变化——其底物AIR（代谢中产物）会在胞内积累聚合形成红色产物，使菌落颜色由野生型的白色变为红色。这种肉眼直观的颜色变化可以作为初步判定菌株基因型及筛选的依据，ADE2也因此成为系统性筛选中应用广泛的标记基因。而ADE4基因突变会从第一步阻断该通路，使细胞无法合成AIR等中间产物，菌落颜色依旧为白色。图-2酿酒酵母嘌呤核苷酸从头合成途径1.实验用具及材料ExTaqDNA聚合酶、rTaq、10XPCRbuffer、dNTP、25mMMgSO4、无菌去离子水、PCR仪、1M醋酸锂、鲑鱼精DNA、PEG3350、100XTE（pH8.0）缓冲液、二甲基亚砜（DMSO）、20%TritonX100培养基:YPD、Sc-ura、Sc-leu，Sc-ade酵母菌株BY4741：MATa,his3Δ1,leu2Δ0,met15Δ0,ura3Δ0酵母菌株BY4742:MATalpha,his3Δ1,leu2Δ0,lys2Δ0,ura3Δ0质粒：pRS415（CENLEU2），pRS416（CENURA3）100℃金属浴、30℃培养箱、42℃水浴锅、30℃摇床、离心机4.实验方法及步骤1、扩增基因敲除片段1)引物设计原理：基因特异性同源臂+统一载体序列图-3基因敲除引物设计示意图ADE2Up:5’-CAATCAAGAAAAACAAGAAAATCGGACAAAACAATCAAGTAGATTGTACTGAGAGTGCAC-3’Down:5’-ATAATTATTTGCTGTACAAGTATATCAATAAACTTATATACTGTGCGGTATTTCACACCG-3’ADE4Up:5’-AAGTTTAGCAAAGAAAGAGGTACAGCAAACAGCAGAATAGAGATTGTACTGAGAGTGCAC-3’Down:5’-AACTATTTTACATACAACTGAACAAGTTCGGAACAATCTACTGTGCGGTATTTCACACCG-3’斜体部分表示基因特异性同源臂2)PCR反应体系10XPCRbuffer5μldNTP5μlUp引物(10μM)1μlDown引物(10μM)1μlExtaq0.5μl模板（pRS415/pRS416）0.5μl无菌去离子水37μl总体积50μl3)PCR程序设置94℃预变性2min;94℃变性20s,55℃退火30s,72℃延伸1min30s/2min30s,重复10个循环;94℃变性20s,65℃退火30s,72℃延伸1min30s/2min30s,重复20个循环;72℃保温7min;4℃保存。4)PCR产物电泳采用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。ade2::URA3约1230bpade4::LEU2约2355bp2、酵母菌转化1）从平板上挑取酵母菌BY4741及BY4742单克隆接种到5mlYPD培养基中，30℃摇床过夜培养。2）第二天测菌株浓度（OD600），转接适量体积的细胞到新的5mlYPD中，使起始OD600为0.1。继续在30℃摇床内培养4-6小时，使OD600约为0.6。3）3000rpm,室温5分钟，将细胞离心至管底，倒掉上层培养基。将鲑鱼精DNA（ssDNA）置于100℃金属浴中煮5分钟后，迅速置于冰上冷却（可在细胞培养过程中准备）。4）用1ml无菌水将细胞重悬，并转移到1.5mlEP管中。3000rpm，1min，弃上清。5）用0.1M醋酸锂/TE1ml重悬，3000rpm，1min，弃上清。6）准备转化液。转化液配方：50%PEG3350312μl1M醋酸锂41.1μlDMSO48μl10mg/mlssDNA25μl7)用100μl0.1M醋酸锂/TE将细胞重悬，向其中加入20μl的PCR产物及400μl的转化液。混匀，置于30℃培养箱温育45分钟。8）42℃热激20分钟。9）3000rpm，室温离心2分钟，弃上清。10）用1ml5mMCaCl2重悬细胞，3000rpm，室温离心1分钟，弃上清，以洗去残留的转化液。11）用200μl5mMCaCl2重悬细胞,将细胞均匀涂布到对应Sc-ura或Sc-leu平板上，置于30℃培养箱培养。12）第三天观察平板上克隆生长状况并记录菌落颜色。3、鉴定菌株基因型1）在Sc-ura平板上选取红色单菌落，重新划线到新的Sc-ura或Sc-leu平板上，置于30℃培养箱培养两天以获得单菌落进行PCR鉴定。2)在Sc-leu平板上挑取单菌落，在新的Sc-leu平板上涂成小块，置于30℃培养箱培养一天。影印到Sc-ade平板，培养一天，最终在挑选Sc-leu上生长，Sc-ade不长的菌落进行PCR鉴定。3）设计引物做菌株基因型鉴定菌株基因型鉴定所需引物如下图所示图-4鉴定引物设计示意图ade2::URA3F:GGCTACGAACCGGGTAATACR1:TCGGCGTACAAAGGACGATCR2:GCGGATAATGCCTTTAGCGGF3:CCTAGAGGTGTTCCAGTAGCF4：TGGATGATGTGGTCTCTACAGGR：GTTACACGGTACAGTCACTGF/R1约730bpF/R2约660bpF3/R约650bpF4/R约670bpade4::LEU2F:CATGCGGCAAATGTCAGAGCR1:CATAACCGCCACGGCATAAAR2:GTGATGCTGTCGCCGAAGAAF3:CCCCAGCCATTCGTTACAACF4：TAGACCGCTCGGCCAAACAAR：GTCCATCCTATGGTGGCGTAF/R1约780bpF/R2约780bpF3/R约740bpF4/R约640bp同一菌株进行四组PCR来鉴定基因型同一菌株F/R1和F/R2只有一组能扩增出产物;同一菌株F3/R和F4/R只有一组能扩增出产物4）挑取适量细胞重悬到20μl的无菌水中。5）配制PCR反应体系,混匀无菌双蒸水6.0μL10×反应缓冲液(TaKaRa)1.5μLdNTP混合液(TaKaRa)1.2μL20%TritonX1000.75μL上游引物F(10μM)0.2μL下游引物R1或R2(10μM)0.2μLrTaq0.15μL细胞悬浮液5.0μL总体积15μL5)反应条件94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃50s,重复35个循环;72℃7min;4℃保存。6)PCR产物电泳检测。记录实验结果并分析菌株基因型，获得正确的ade2::URA3及ade4::LEU2菌株。5.作业及思考题1、记录基因敲除片段的扩增结果，并在图中标注出目的条带。2、观察Sc-ura及Sc-leu转化平板上的克隆生长状况并记录菌落颜色，分析导致该现象的原因。3、讨论分析影响酵母同源重组效率的因素。4、记录并分析菌株基因型鉴定结果。参考文献1JunbiaoDaiandJefD.Boeke,StrainconstructionandscreeningmethodsforayeasthistoneH3/H4mutantlibrary,MethodsinMolecularBiology,2012,833:1-142Brachmann,C.B.etal.DesignerdeletionstrainsderivedfromSaccharomycescerevisiaeS288C:ausefulsetofstrainsandplasmidsforPCR-mediatedgenedisruptionandotherapplications.Yeast.1998,14(2):115-323Longtine,M.S.etal.AdditionalmodulesforversatileandeconomicalPCR-basedgenedeletionandmodificationinSaccharomycescerevisiae.Yeast,1998,14(10):953-614ZonneveldBJandvanderZandenAL.TheredademutantsofKluyveromyceslactisandtheirclassificationbycomplementationwithclonedADE1orADE2genesfromSaccharomycescerevisiae.Yeast,1995,11(9):823-7酿酒酵母二倍体菌株制备1、实验目的掌握酿酒酵母二倍体制备方法，了解酵母的单倍体、二倍体细胞特点和交配过程的分子机理。2、实验原理酵母菌能以单倍体和二倍体的形式存在，且都是通过有丝分裂进行繁殖。酵母细胞能在母细胞中产生一个芽，逐步扩大并最终与母体分离。酵母的单倍体菌株具有两种交配型：MATa和MATalpha。和哺乳动物的两种性别一样，两种单倍体酵母可以进行交配，形成二倍体。而二倍体菌株在一定条件下能进行减数分裂形成单倍体，这样就实现了酵母不同生命周期间的转换。在自然界中，酿酒酵母经常分裂一次就会进行交配型的转换。这种转换是由一种核酸内切酶（HO）所诱发，HO能在MAT位点处进行特异性切割，形成双链断裂。随后基因组中与此位点高度同源的但属于组成型沉默位点的HMLalpha或HMR