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ICS65.020.30B43中华人民共和国国家标准GB/T31581—2015牛性控冷冻精液生产技术规程Codeofpraticeonproductionofbovinefrozensexed-semen2015-05-15发布2015-10-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)、内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(南京)。本标准主要起草人:张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、陆汉希、杨清峰、武玉波、钱松晋、张海涛、刘玉、赵鹏、王建国、胡树香、张勇、胡志刚。ⅠGB/T31581—2015牛性控冷冻精液生产技术规程1范围本标准规定了牛性控冷冻精液生产的器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精子分离、冷冻、解冻、检验、包装、贮存及运输。本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4143牛冷冻精液GB/T5458液氮生物容器GB/T31582牛性控冷冻精液NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1精子分离spermsorting根据X精子和Y精子DNA含量的差异,利用流式细胞分离方法将X精子和Y精子分离开。3.2性控冷冻精液frozensexed-semen分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。4采精用品清洗和消毒按照NY/T1234的规定执行。5溶液配制与灭菌5.1溶液配制5.1.1稀释液稀释液配制见附录A中A.1。5.1.2分离机缓冲液Tris-sheath分离机缓冲液Tris-sheath的配制见A.2。1GB/T31581—20155.1.3荧光染色液和食品红染色液荧光染色液和食品红染色液配制见A.3。5.1.4精子染色液精子染色液的配制见A.4。5.1.5精子收集液精子收集液配制见A.5。5.2溶液灭菌溶液在使用前进行高压蒸汽灭菌(120kPa,15min),对于不能高压灭菌的溶液使用0.22μm过滤器进行过滤除菌。6主要仪器设备流式细胞仪、精液分装机、细管印字机、程序冷冻仪、荧光显微镜、离心机、精子密度仪。7采精按照NY/T1234的规定执行。8精液处理精液处理方法按照NY/T1234的规定执行,精液分离前应添加抗生素并在18℃~20℃的环境下保存,储存时间不超过16h。9精子分离9.1分离环境精子分离实验室应保持洁净,室温控制在18℃~25℃,无振动源。9.2分离前处理根据所采原精密度,按比例进行染色。示例:对4亿个精子进行染色,用染色原液稀释到2亿个/mL,加入15μL~30μLHochest33342荧光染色液放入5mL分离专用试管,混匀后放入34℃水浴,加盖避光温育45min。再加入2mL含4%卵黄的食品红染色液,最后制成精子分离样品。9.3分离按照分离机操作规程分离。2GB/T31581—201510分离精液冷冻10.1稀释平衡分离后的精液在4℃±1℃条件下平衡90min后同温1750g离心5min,去除上清液。然后用20%卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液,使精子密度≥2000万个/mL。之后添加等量的含12%甘油的Tris-B液,平衡20min。用1∶1的Tris-A液、Tris-B液将最终精子密度调整为≥1000万个/mL。10.2分装平衡后的精液在4℃±1℃条件下灌装、封口、印字,在细管上打印生产单位代号、品种、牛号、生产日期或批号(见附录B)、性控标记等信息。10.3冷冻、包装在4℃±1℃条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上,然后移入冷冻仪中,冷冻的初冻温度调节至-90℃,控制降温过程,在20min到达-120℃后投入液氮中。冷冻结束后进行包装,包装应在-140℃以下进行。保存性控冷冻精液的液氮生物容器应符合GB/T5458的规定。11入库前检查性控冷冻精液产品的质量应由专职的质量检验员负责检测,每批性控冷冻精液入库前应进行常规检验,方法见GB/T31582。检验合格后方可入库。12贮存、运输按照NY/T1234的规定执行。3GB/T31581—2015附录A(规范性附录)牛性控冷冻精液生产相关溶液配制A.1溶液配制试剂纯度应达到分析纯。A.1.1Tris-A工作液取TrizmaBase35.32g、柠檬酸17.21g、D-果糖12.65g溶于750mL双蒸水,搅拌30min,再加入双蒸水至1000mL。溶液pH调到6.8,然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,5℃±1℃保存,有效期14d。A.1.220%卵黄Tris-A液取Tris-A工作液199mL,添加51mL卵黄液,搅拌15min,5℃±1℃静置12h,去除沉淀,吸出表层卵脂后,在18500g的条件下离心。然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,加入抗生素,5℃±1℃保存,有效期7d。A.1.3Tris-B工作液取TrizmaBase35.746g、柠檬酸19.980g、D-果糖14.712g溶于750mL双蒸水,搅拌30min,再加入双蒸水至1000mL。溶液pH调到6.8,然后用0.22μm的过滤器过滤除菌,5℃±1℃保存,有效期14d。A.1.412%甘油Tris-B液先用Tris-B工作液配制23%(体积分数)卵黄液,搅拌15min后置5℃±1℃条件下12h析出沉淀。静置后吸出表层卵脂,并在18500g的条件下进一步离心沉淀。然后用0.22μm的过滤器过滤除菌。再加入甘油使甘油终浓度达到12%(体积分数)。溶液pH调到6.8,加入抗生素,在5℃±1℃保存,有效期7d。A.2分离机缓冲液Tris-sheath配制配制20LTris-sheath工作液:取TrizmaBase477.6g、柠檬酸232.6g、D-果糖171.0g溶于3.0L双蒸水中搅拌30min,并加盐酸把pH调到6.8,然后添加抗生素用0.22μm的过滤器过滤灭菌,再加双蒸水至20.0L容量,调节pH至6.8,渗透压290mOsm±10mOsm。在5℃±1℃保存,有效期14d。A.3荧光染色液和食品红染色液配制A.3.10.5%荧光染色液将10mg荧光染料Hochest33342定容于2mL双蒸水中,在5℃±1℃条件下避光保存,有效期90d。4GB/T31581—2015A.3.25%食品红染色液将0.5g食品红染料定溶于10mL双蒸水中,0.22μm过滤除菌,在5℃±1℃条件下避光保存。有效期为90d。A.4精子染色液配制A.4.1精子染色原液100mL精子染色原液:依次称取HEPES0.925g、氯化镁(MgCl2·6H2O)0.008g、氯化钠(NaCl)0.5518g、氯化钾(KCl)0.0224g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.004g、碳酸氢钠(NaHCO3)0.084g、丙酮酸钠0.022g、葡萄糖0.09g、乳酸钠0.361mL、BSA0.3g,溶于100mL双蒸水中,调整pH至7.4,加入0.25mL庆大霉素(10mg/mL),0.22μm过滤灭菌后,在5℃±1℃保存,有效期为7d~10d。A.4.2含4%卵黄的食品红染色液A.4.1中100mL精子染色原液,加入0.261mL食品红染色液,形成食品红染色液。取96mL食品红染色液添加4mL卵黄,搅拌后在5℃条件下静置12h。去除卵黄颗粒沉淀,18500g离心30min,调整pH至5.5,然后加入0.25mL庆大霉素(10mg/mL),经过0.22μm过滤灭菌,在5℃±1℃保存,使用期限为14d。A.5精子收集液配制取20%卵黄Tris-A液100mL,加入16mL双蒸水,充分摇匀。5℃±1℃保存,有效期7d。5GB/T31581—2015附录B(规范性附录)细管性控冷冻精液标记方法细管性控冷冻精液标记由20个字符、5个部分组成,每部分之间空开2个字符位置,排列顺序如下:第一部分第二部分第三部分第四部分第五部分生产单位代号品种代号公牛注册号生产日期性控标记三个字符二个字符五个字符六个字符四个字符第一部分公牛站代号以农业部公布的公牛站代号为准(参照NY/T1234标准执行);第二部分品种代号以GB4143为依据;第三部分公牛号取该牛身份证号码的后五位数;第四部分冻精生产日期六位数按年、月、日次序排列,年、月、日各占二位数;第五部分性控标记:性控或XK,X为雌性,Y为雄性。每部分之间间隔2个字符位置。标记的字迹应清晰易认。示例:×××为生产单位代号,HS为荷斯坦公牛的品种代号,×××××为该公牛身份证号码的后五位数,××××××为20××年××月××日的生产日期,XK-X代表性控X精子。6GB/T31581—20155102—18513T/BG中华人民共和国国家标准牛性控冷冻精液生产技术规程GB/T31581—2015*中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址:服务热线:400-168-0010010-685220062015年6月第一版*书号:155066·1-51984版权专有侵权必究