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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１２９—２００７代替ＳＮ／Ｔ１１２９．１～１１２９．２—２００２牛病毒性腹泻／粘膜病检疫规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺犲犪／犿狌犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲２００７０８０６发布２００８０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准代替ＳＮ／Ｔ１１２９．１—２００２《牛病毒性腹泻／粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１２９．２—２００２《牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离操作规程》。本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍蕾。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１２９．１—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１２９．２—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１２９—２００７牛病毒性腹泻／粘膜病检疫规范１ 范围本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范。本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 疾病概述牛病毒性腹泻（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａ，ＢＶＤ）是由牛病毒性腹泻病毒（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生犊牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。粘膜病（ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅ，ＭＤ）也是由ＢＶＤＶ引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、糜烂、溃疡为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起，但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿龈边沿糜烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高，临床症状明显，发病率低，而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录Ａ。４ 检疫方法４．１ 病毒分离和鉴定４．１．１ 仪器试剂４．１．１．１ 倒置荧光显微镜。４．１．１．２ 二氧化碳培养箱。４．１．１．３ １０ｍＬ标准细胞培养瓶，２４孔平底细胞培养板，带盖湿盒。４．１．１．４ 无ＢＶＤ抗体胎牛血清，细胞分散液。４．１．１．５ ＢＶＤ标准毒株（ＯｒｅｇｏｎＣ２４或ＮＡＤＬ）和标准阳性血清，ＢＶＤ荧光抗体，ＢＶＤ酶标抗体。４．１．１．６ 细胞：使用ＭＤＢＫ细胞或三代以内未感染ＢＶＤ病毒的胎牛肾细胞（ＢＫ）。４．１．１．７ 溶液及细胞培养液：配制参见附录Ｂ。４．１．２ 样品的采集４．１．２．１ 对于牛群、种牛的检疫，应无菌采集血液或者精液。４．１．２．２ 对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛，应采集血凝块和肠系膜淋巴结。４．１．２．３ 对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。４．１．３ 样品的处理４．１．３．１ 血液用常规方法分离血清，血凝块应冻融３次后，取析出的上清液。４．１．３．２ 精液冻融３次（或超声波裂解）后，按规定稀释，离心取上清液。４．１．３．３ 动物组织加１０倍体积含有１０００ＩＵ／ｍＬ双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液。１犛犖／犜１１２９—２００７４．１．４ 样品的培养４．１．４．１ 取生长良好，形成８０％以上单层的ＭＤＢＫ细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种１ｍＬ，每个样品接种３个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。４．１．４．２ 置３７℃二氧化碳培养箱吸附３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。４．１．４．３ 倒去样品，加入维持液，３７℃二氧化碳培养箱培养６ｄ。４．１．４．４ 收获病毒，同一样品３瓶混合，放至－２０℃冻融３次后进行下一步鉴定。４．１．５ 荧光抗体法鉴定４．１．５．１ 将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，加入２４孔细胞培养板内，每孔０．８ｍＬ，置３７℃培养。４．１．５．２ 待细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔４００μＬ，每个样品４个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物。４．１．５．３ 置３７℃二氧化碳培养箱吸附３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。４．１．５．４ 吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔０．８ｍＬ，置３７℃二氧化碳培养箱培养３ｄ。４．１．５．５ 弃掉２４孔培养板内的培养液，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）漂洗自然干燥后，用－２０℃丙酮固定１５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，自然干燥。４．１．５．６ 取固定好的２４孔培养板，每个待检样品及阴性、阳性和空白细胞对照孔分别加入ＢＶＤ阳性血清各２孔，每孔４００μＬ，置３７℃作用１ｈ。４．１．５．７ 弃掉板孔内的ＢＶＤ阳性血清，在所有板孔内加入工作浓度的ＢＶＤ荧光抗体４００μＬ，放进湿盒，３７℃作用２ｈ。４．１．５．８ 用ＰＢＳ洗３次，倾去液体，自然干燥。４．１．５．９ 镜检。４．１．５．１０ 结果判定阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；阴性对照、空白对照无荧光。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，为可疑，需重检。重检后细胞孔仍然荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。如果阳性对照无特异性荧光，则试验失败，应重新检测。４．１．６ 免疫过氧化物酶单层法（犐犘犕犃）鉴定４．１．６．１ 取４．１．５．６固定的２４孔板，弃掉板孔内的ＢＶＤ阳性血清，在所有板孔内加入工作浓度的ＢＶＤ酶标抗体４００μＬ，放进湿盒，３７℃作用１ｈ。４．１．６．２ 弃去板中液体，用洗液洗板３次，每次１ｍｉｎ～３ｍｉｎ，最后在吸水纸上轻轻拍干。４．１．６．３ 每孔加入显色／底物溶液４００μＬ，封板于室温（１８℃～２４℃）下感作３０ｍｉｎ。４．１．６．４ 弃去板中液体，洗涤１次，方法同４．１．６．２，再用三蒸水洗涤２次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。４．１．６．５ 结果判定与解释将２４孔板置于倒置显微镜判读。阳性对照在显微镜下细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染，阴性对照、空白对照无棕红色着染。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔出现棕红色着染，而经过阳性抗体抑制的同一样品无棕红色着染，则判为阳性。如果对照不成立，则试验失败，重新检测。２犛犖／犜１１２９—２００７４．２ 微量血清中和试验４．２．１ 仪器试剂４．２．１．１ 溶液及细胞培养液：参见附录Ｂ。４．２．１．２ ＢＶＤ标准毒株（ＯｒｅｇｏｎＣ２４或ＮＡＤＬ）和标准阳性、阴性血清。４．２．１．３ 细胞：使用ＭＤＢＫ细胞或三代以内未感染ＢＶＤ病毒的胎牛肾细胞（ＢＫ）。４．２．１．４ 被检血清：无菌自牛静脉采血，分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过５６℃、３０ｍｉｎ灭活处理。４．２．１．５ 无ＢＶＤ抗体胎牛血清，细胞分散液。４．２．１．６ ５０ｍＬ标准细胞培养瓶，９６孔无菌细胞培养板，５０μＬ、１００μＬ微量可调移液器。４．２．１．７ 倒置光学显微镜。４．２．１．８ 二氧化碳培养箱。４．２．２ 种毒的制备将ＢＶＤ标准毒用维持液作１０倍稀释，取长成良好单层的细胞，用ＰＢＳ洗１次后，按培养液十分之一的量接种病毒，置３７℃作用３０ｍｉｎ，加入维持液，３７℃二氧化碳培养箱培养至８０％细胞出现病变，收获病毒，放至－２０℃冻融３次或者超声波（６０Ｗ）裂解８个循环，每次１５ｓ，冰浴４５ｓ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，分装小瓶，置－７０℃保存备用。４．２．３ 病毒的毒力测定将制备的标准病毒抗原，用维持液作１０倍递增稀释至１０－８，每个滴度接种细胞培养板８个孔，每孔５０μＬ，随后每孔加入细胞悬液（３×１０５／ｍＬ）１００μＬ和细胞维持液５０μＬ。同时每板设８孔细胞对照。置３７℃二氧化碳培养箱，逐日观察至６ｄ，记录细胞病变，按Ｒｅｅｄｍｕｅｎｃｈ或Ｋａｒｂｅｒ方法计算细胞半数感染量（ＴＣＩＤ５０／５０μＬ）。４．２．４ 操作程序４．２．４．１ 阴性血清对照：每孔加阴性血清５０μＬ、１００ＴＣＩＤ５０的病毒悬液５０μＬ，设４孔。４．２．４．２ 阳性血清对照：每孔加阳性血清５０μＬ、１００ＴＣＩＤ５０的病毒悬液５０μＬ，设４孔。４．２．４．３ 被检样品：在定量试验中，先将被检血清用维持液作１∶２、１∶４连续倍比稀释至２－８后加到９６孔板中，每一稀释度４孔，每孔５０μＬ，然后每孔再加１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ的病毒悬液５０μＬ。在定性试验中，将被检血清增加一个稀释度即１∶５稀释，其他步骤与定量方法相同。４．２．４．４ 被检样品毒性对照：每孔加被检血清原样１００μＬ，设４孔。４．２．４．５ 细胞对照：每孔加１００μＬ维持液，设４孔。４．２．４．６ 病毒回归对照：将ＢＶＤ病毒稀释成１００、１０、１、０．１ＴＣＩＤ５０，每个稀释度４孔，每孔加病毒悬液５０μＬ，维持液５０μＬ。４．２．４．７ 以上对照和被检样品置３７℃温箱中作用１ｈ后，每孔加入３×１０５个／ｍＬ细胞悬液１００μＬ，置３７℃二氧化碳培养箱培养。４．２．５ 结果判定在３７℃二氧化碳培养箱培养第４天开始观察结果，连续观察３天判定结果。当病毒用量在３０ＴＣＩＤ５０／５０μＬ～３００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ范围内，阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，予以重做。４．２．６ 判定标准在定量试验中，按Ｒｅｅｄｍｕｅｎｃｈ或Ｋａｒｂｅｒ方法计算半数保护量（ＰＤ５０），即为该血清的中和效价。在定性试验中，被检血清在１∶５稀释度时有两个或两个以上孔的细胞完全被保护，该血清即为３犛犖／犜１１２９—２００７阳性。４．３ 抗原捕获酶联免疫吸附试验４．３．１ 试验材料牛病毒性腹泻／粘膜病抗原捕获ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒２℃～８℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：牛病毒性腹泻粘膜病病毒多克隆抗体包被板；抗ＢＶＤＶ单克隆检测抗体；ＢＶＤＶ阳性对照血清；ＢＶＤＶ阴性对照血清；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的牛抗鼠抗体；１０×样品稀释液；１０×浓缩洗液；ＴＭＢ底物溶液；终止液。４．３．２ 样品的准备４．３．２．１ 组织样品使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在２℃～８℃保存一个月或长期冷冻保存，样品最好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏，用剪刀将１ｇ～２ｇ样品剪碎（２ｍｍ～５ｍｍ），将剪碎的样品置于１０ｍＬ离心管中，加入５ｍＬ样品稀释液（１×），混匀，室温感作１ｈ～２ｈ，１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液作为检测样品备用。４．３．２．２ 外周血液白细胞将肝素或ＥＤＴＡ抗凝血样１０ｍＬ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。用１０００μＬ移液器吸取沉淀表层的淡黄色液体，重悬于５００μＬ样品稀释液中，每个样品换一个吸头。置室温１ｈ，期间涡旋振荡数次，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液作为检测样品备用。如果样品的压缩细胞体积非常小，则用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到１０ｍＬ离心管中，并加入等体积２℃～８℃预冷的０．１７ｍｏｌ／Ｌ的氯化铵（ＮＨ４Ｃｌ）溶液，置室温１０ｍｉｎ。加入２℃～８℃预冷的超纯水（或双蒸水）适量，轻轻翻转摇匀，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。弃去上清液，加入５００μＬ样品稀释液（１×）到血细胞中，每个样品使用新的吸头，涡动混匀，置室温１ｈ，期间涡旋振荡数次。２５００ｒ／