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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１８７０—２００７食品中致病菌检测方法 实时犘犆犚法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犳狅狅犱—犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犕犲狋犺狅犱２００７０４０６发布２００７１０１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、卢行安、肖性龙、李苏龙、孙杰、李丽、许业莉、顾鸣、谢昭聪、朱海、张经纬。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１８７０—２００７食品中致病菌检测方法 实时犘犆犚法１ 范围本标准规定了食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的实时ＰＣＲ检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的快速检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＳＮ０１７０ 出口食品中沙门氏菌检验方法ＳＮ０１７２ 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法ＳＮ０１７３ 出口食品中副溶血性弧菌检验方法ＳＮ０１７４ 出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法ＳＮ０１７５ 出口食品中空肠弯曲菌检验方法ＳＮ／Ｔ０１８４．１ 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法ＳＮ／Ｔ０９７３ 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７检验方法ＳＮ／Ｔ１０２２ 出口食品中霍乱弧菌检验方法ＮＭＫＬＮｏ．１５６ 食品中致病性弧菌的检测和计数３ 定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩略语适用于本标准。３．１ 定义和术语３．１．１ 实时荧光犘犆犚 狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚实时荧光聚合酶链式反应。３．１．２ 犆狋值 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱犆狋每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３．２ 缩略语３．２．１ 犘犆犚 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链反应，简称ＰＣＲ。１犛犖／犜１８７０—２００７３．２．２ 犇犖犃 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犾犲犻犮犪犮犻犱脱氧核糖核酸。３．２．３ 犱犖犜犘 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷酸三磷酸。３．２．４ 犱犃犜犘 犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．２．５ 犱犆犜犘 犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．２．６ 犱犌犜犘 犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．２．７ 犱犜犜犘 犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．２．８ 犱犝犜犘 犱犲狅狓狔狌狉犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．２．９ 犝犖犌 狌狉犪犮犻犾犖犵犾狔犮狅狊狔犾犪狊犲尿嘧啶犖糖基化酶。３．２．１０ 犜犪狇 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌水生栖热菌。３．２．１１ 犜狉犻狊 狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三（羟甲基）氨基甲烷。３．２．１２ 犉犃犕 ６犮犪狉犫狅狓狔犳犾狌狅狉犲狊犮犲犻狀６羧基荧光素。３．２．１３ 犜犃犕犚犃 ６犮犪狉犫狅狓狔狋犲狋狉犪犿犲狋犺狔犾狉犺狅犱犪犿犻狀犲６羧基四甲基罗丹明。４ 测定方法４．１ 方法提要在ＰＣＲ基础上，加入一条与模板ＤＮＡ匹配的、两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针。ＰＣＲ每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即ＰＣＲ产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｖａｌｕｅ）时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量。２犛犖／犜１８７０—２００７样品的模板ＤＮＡ进行实时ＰＣＲ扩增，观察实时ＰＣＲ的增幅曲线，从而对食品中的致病菌进行快速检测。４．２ 设备和材料４．２．１ 实时ＰＣＲ仪。４．２．２ 离心机。４．２．３ 微量移液器和灭菌吸头：１０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。４．２．４ 恒温培养箱。４．２．５ 恒温水浴锅。４．２．６ 天平。４．２．７ 均质器或乳钵。４．２．８ 灭菌三角烧瓶：５００ｍＬ，２５０ｍＬ。４．２．９ 灭菌吸管：１０ｍＬ。４．２．１０ 灭菌平皿：９０ｍｍ×１５ｍｍ。４．２．１１ 灭菌试管：内径３ｍｍ，长５ｃｍ。４．２．１２ 接种棒、镍铬丝。４．２．１３ 试管架、试管篓。４．２．１４ 废液缸。４．３ 试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。４．３．１ 水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．３．２ 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。４．３．３ ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。４．３．４ ＤＮＡ提取试剂：称取０．１ｇｃｈｅｌｅｘ１００粉末，加入１００ｍＬ灭菌蒸馏水中，摇匀即可，也可使用商业化的ＤＮＡ提取试剂盒。４．３．５ １０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４），２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾（ＫＣｌ）１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁（ＭｇＣｌ２）。４．３．６ 引物和探针：引物和探针序列见表Ａ．１，其中探针的５’端标记ＦＡＭ，３’端标记ＴＡＭＲＡ。４．４ 检测步骤４．４．１ 样品制备、增菌培养和分离沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ０１７０进行。金黄色葡萄球菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ０１７２进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ０１７４进行。食品中单核细胞增生李斯特氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ／Ｔ０１８４．１进行。空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ０１７５进行。肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ／Ｔ０９７３进行。副溶血性弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ０１７３进行。霍乱弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＳＮ／Ｔ１０２２进行。创伤弧菌和溶藻弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照ＮＭＫＬＮｏ．１５６进行。４．４．２ 模板犇犖犃的制备４．４．２．１ 增菌液模板犇犖犃的制备取４．４．１中培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）１ｍＬ，加到１．５ｍＬ无菌离心管中，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸弃上清；加入５０μＬＤＮＡ提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清保存于－２０℃备用以待检测。３犛犖／犜１８７０—２００７４．４．２．２ 可疑菌落模板犇犖犃的制备挑取４．４．１中分离到的可疑菌落或菌体，加入５０μＬＤＮＡ提取液，再按照４．４．２．１步骤制备模板ＤＮＡ以待检测。也可使用商业化的ＤＮＡ提取试剂盒并按其说明制备模板ＤＮＡ。４．４．３ 实时犘犆犚检测４．４．３．１ 反应体系体积为２５μＬ：１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ、引物对（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、水１７μＬ、模板ＤＮＡ２μＬ。４．４．３．２ 反应条件：３７℃５ｍｉｎ，９５℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性５ｓ，６０℃退火延伸４０ｓ，同时收集ＦＡＭ荧光，进行４０个循环，４℃保存反应产物。 注：ＰＣＲ反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。４．４．３．３ 检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子ＤＮＡ或阳性菌株ＤＮＡ，空白对照为无菌水。５ 结果及判断５．１ 质控标准———阴性对照：无扩增曲线，犆ｔ≥４０；———阳性对照：出现典型的扩增曲线，犆ｔ值应＜３０．０。否则，实验视为无效。５．２ 结果判定和报告———犆ｔ值≥４０，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出相对应致病菌；———犆ｔ值≤３５．０，可判定该样品结果为阳性；———犆ｔ值＞３５．０而＜４０，建议样本重做。重做结果犆ｔ值≥４０者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见规范性引用文件中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。６ 测定低限 在上述条件下，本方法对于各致病菌的测定低限见表１。表１ 食品中１１种致病菌的测定低限致病菌名称测定低限／（ＣＦＵ／ｍＬ）沙门氏菌５０００志贺氏菌３００金黄色葡萄球菌７０００小肠结肠炎耶尔森氏菌５００单核细胞增生李斯特氏菌２５００空肠弯曲菌５００致病菌名称测定低限／（ＣＦＵ／ｍＬ）肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７２９１副溶血性弧菌２００霍乱弧菌８４创伤弧菌５００溶藻弧菌１０００７ 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录Ｂ。８ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。并参见ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。４犛犖／犜１８７０—２００７附 录 犃（规范性附录）食品中致病菌实时犘犆犚检测所用引物和探针序列表犃．１ 食品中致病菌实时犘犆犚检测所用引物和探针序列致病菌名称引物序列探针序列沙门氏菌５’ＧＣＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡ３’５’ＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧ３’５’ＣＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴ３’志贺氏菌５’ＣＧＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＣ３’５’ＴＣＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＴＴ３’５’ＡＡＣＡＧＧＴＣＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡ３’金黄色葡萄球菌５’ＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡ３’５’ＧＧＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＣＧＧＣＴ３’５’ＣＡＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＴ３’小肠结肠炎耶尔森氏菌５’ＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡ３’５’ＴＴＣＴＧＣＧＡＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＣＡＣＡ３’５’ＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧ３’单核细胞增生李斯特氏菌５’ＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴ３’５’ＣＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＴＡ３’５’ＡＴＡＣＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧ３’空肠弯曲菌５’ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＴ３’５’ＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＴＡＡＧＴ３’５’ＡＴＧＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡ３’（ＭＧＢ）肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７５’ＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧ３’５’ＡＴＣＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＣ３’５’ＴＡＴＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧ３’副溶血性弧菌５’ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴ３’５’ＣＡＴＴＣＧＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＣ３’５’ＣＧＣＡＣＡＡＧＧＣＴＣＧＡＣＧＧＣＴＧＡ３’霍乱弧菌５’ＧＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＧＡＴＧＣＧＴＴＡＡＡＣ３’５’ＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＴＣＡ３’