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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１９９９—２００７牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犪狀狋犻犵犲狀犮犪狆狋狌狉犲犱犲狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔犳狅狉犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺狅犲犪犿狌狊犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲２００７１２２４发布２００８０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程ＳＮ／Ｔ１９９９—２００７中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数８千字２００８年２月第一版 ２００８年２月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１８４５９ 定价６．００元书书书前 言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：董志珍、侯艳梅、赵祥平、肖妍、霍蕾。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１９９９—２００７牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程１ 范围本标准规定了牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）操作方法。本标准适用于牛病毒性腹泻粘膜病抗原的检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法（ｎｅｑＩＳＯ３６９６）３ 原理以边界病病毒特异性抗体包被酶标板，同时加入ＢＶＤＶ检测单克隆抗体及样品，样品即与两种抗体结合，形成抗原抗体结合物，洗板后再加入二抗（与抗原抗体复合物结合）及底物，通过测量光密度值而确定样品的结果。４ 试验材料４．１ 牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获犈犔犐犛犃诊断试剂盒２℃～８℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：ａ） 牛病毒性腹泻粘膜病病毒多克隆抗体包被板；ｂ） 抗ＢＶＤＶ单克隆检测抗体；ｃ） ＢＶＤＶ阳性对照；ｄ） ＢＶＤＶ阴性对照；ｅ） 辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的牛抗鼠抗体；ｆ） １０×样品稀释液；ｇ） １０×浓缩洗液；ｈ） ＴＭＢ底物溶液；ｉ） 终止液。４．２ 样品的处理４．２．１ 组织４．２．１．１ 使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在２℃～８℃保存１个月或长期冷冻保存。组织样品最好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏。４．２．１．２ 用剪子将１ｇ～２ｇ的样品剪碎（２ｍｍ～５ｍｍ）。４．２．１．３ 将剪碎的样品置于１０ｍＬ的离心管中，加入５ｍＬ样品稀释液（１×），混匀，室温感作１ｈ～２ｈ。４．２．１．４ １５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取５０μＬ上清液作为检测用样品。按第７章进行试验。４．２．２ 外周血液白细胞４．２．２．１ 将肝素或ＥＤＴＡ抗凝的血样１０ｍＬ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。１犛犖／犜１９９９—２００７４．２．２．２ 用１０００μＬ移液器小心吸取血沉表层的淡黄色薄膜，重悬于５００μＬ的样品稀释液中，每一个样品换一个吸头。室温放置１ｈ，在此期间偶尔漩涡振荡一次，下面继续４．２．２．６的操作。４．２．２．３ 如果样品的压缩细胞体积非常小，那么用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到１０ｍＬ离心管中，并加入等体积的２℃～８℃预冷的０．１７ｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ｃｌ溶液，放入离心管中，室温放置１０ｍｉｎ。４．２．２．４ 将离心管用２℃～８℃预冷的超纯水（或双蒸水）加满，轻轻地翻转摇匀，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。４．２．２．５ 弃去上清液，加入５００μＬ样品稀释液（１×）到血细胞中，每个样品使用新的枪头涡动混匀，室温中放置１ｈ，在此期间偶尔漩涡振荡一次。４．２．２．６ ２５００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，用上清液作为检测样品，按第７章进行试验。４．２．３ 鼻拭子４．２．３．１ 取下拭子头，放入底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空）。将微型离心管放入另一个Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。４．２．３．２ 弃去底部有小孔的微型管，并在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加入与获得的粘液等体积的样品稀释液（１×），混匀，室温下放置１ｈ～２ｈ。此期间偶尔摇晃一下。然后可按第７章操作程序进行试验。４．２．４ 细胞培养物４．２．４．１ 弃去细胞培养液，反复三次冻融后，收集细胞培养液到离心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上清液。４．２．４．２ 加入５００μＬ样品稀释液，振荡器上轻轻混匀，置于室温１ｈ，吸取５０μＬ作为检测用样，按第７章操作程序进行试验。５ 仪器与设备５．１ 酶标仪（波长４５０ｎｍ或双波长４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）。５．２ 振荡器。５．３ 高速台式离心机。５．４ 冰箱。５．５ 温箱。５．６ ８道或１２道洗头洗板机。５．７ ８道或１２道移液器（５０μＬ，３００μＬ）。５．８ 单道移液器（０．５μＬ～１０μＬ；４０μＬ～２００μＬ；２００μＬ～１０００μＬ和２ｍＬ～１０ｍＬ）。５．９ 吸头（１０μＬ，２００μＬ，１０００μＬ）。５．１０ 剪刀和镊子（处理组织样品）。５．１１ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管。６ 试剂准备６．１ 试剂盒各组分在使用前恢复至室温（２０℃～２５℃）。６．２ 水：ＧＢ／Ｔ６６８２所规定的一级水。６．３ ０．１７ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｃｌ溶液（提取白细胞用）。６．４ 洗涤液：用蒸馏水将浓缩洗液稀释１０倍（１∶１０），如３０ｍＬ浓缩液加入２７０ｍＬ蒸馏水，混匀备用。稀释用蒸馏水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。２犛犖／犜１９９９—２００７７ 操作程序７．１ 加抗犅犞犇犞单克隆检测抗体用８道或者１２道移液器在每孔中加入５０μＬ抗ＢＶＤＶ单克隆检测抗体（试剂盒提供）。７．２ 对照加５０μＬ阴性对照血清至酶标板的Ａ１、Ｂ１孔。加５０μＬ阳性对照血清至酶标板的Ａ２、Ｂ２孔。７．３ 加样在酶标板的其他相应孔中各加入５０μＬ已稀释好的被检样品。７．４ 感作将酶标板封膜后，在振荡器上混合１ｍｉｎ后，置２℃～８℃下过夜感作（１４ｈ～１８ｈ）或３７℃下感作３ｈ。７．５ 洗涤弃掉各孔的液体，每孔加入２５０μＬ～３００μＬ已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤５次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，以去除孔内剩余的液体。７．６ 加酶标结合物每孔加入１００μＬ辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的牛抗鼠抗体。７．７ 感作和洗涤将酶标板封膜后，置室温下，感作３０ｍｉｎ。重复７．５洗涤。７．８ 加底物每孔加入１００μＬＴＭＢ底物溶液。７．９ 感作将酶标板置２０℃～２５℃下黑暗处感作１０ｍｉｎ，从加完第一孔开始计时。７．１０ 加终止液每孔加１００μＬ终止液，终止颜色反应。７．１１ 测定吸光值（犗犇）酶标仪以空气作为空白对照，于１５ｍｉｎ内，在４５０ｎｍ波长下测量和记录样品和对照的犗犇值。８ 试验有效性原则只有在阳性对照孔所得的平均值（犘犆犡）减去阴性对照孔所得的平均值（犖犆犡）大于０．１５，且阴性对照孔所得的平均值应小于０．２时，测定结果才有效。９ 结果计算和判定９．１ 结果计算按式（１）、式（２）、式（３）计算结果。犖犆犡＝犗犇Ａ１＋犗犇Ｂ１２………………………………（１） 式中：犖犆犡———阴性对照血清孔犗犇值的平均值；犗犇Ａ１———Ａ１孔阴性对照血清的犗犇值；犗犇Ｂ１———Ｂ１孔阴性对照血清的犗犇值。犛犖／犜１９９９—２００７书书书犛犖／犜１９９９—２００７犘犆犡＝犗犇Ａ２＋犗犇Ｂ２２………………………………（２） 式中：犘犆犡———阳性对照血清孔犗犇值的平均值；犗犇Ａ２———Ａ２孔阳性对照血清的犗犇值；犗犇Ｂ２———Ｂ２孔阳性对照血清的犗犇值。犛／犘＝犗犇Ｓ－犖犆犡犘犆犡－犖犆犡………………………………（３） 式中：犗犇Ｓ———样品孔的犗犇值。９．２ 结果判定如果犛／犘值小于０．２０，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阴性。如果犛／犘值介于０．２０和０．３０之间，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病可疑，应重新检测；重新检测仍为可疑则判为阳性。如果犛／犘值大于等于０．３０，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阳性。７００２—９９９１犜／犖犛书号：１５５０６６·２１８４５９定价： ６．００元