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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６６６—２０１０苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狊犻狊狊狌犫狊狆．犻狀狊犻犱犻狅狊狌狊（犕犮犆狌犾犾狅犮犺）犇犪狏犻狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张乐、张祥林、赵文军、王罛、高文娜、丁翠珍。Ⅰ犛犖／犜２６６６—２０１０苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了苜蓿细菌性萎蔫病菌［犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．犐狀狊犻犱犻狅狊狌狊（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ）Ｄａｖｉｓ］的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境苜蓿种子及其产品中苜蓿细菌性萎蔫病菌的检疫和鉴定。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１８０９ 进出境植物种子检疫规程３ 原理苜蓿细菌性萎蔫病菌的分类地位属于厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、厚壁菌纲（ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）、真细菌目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、棒形杆菌属（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉）。该病菌的生物学特性（参见附录Ａ）、血清学特性和分子生物学特性是制定本标准的主要依据。４ 仪器设备和用具４．１ 仪器设备电子天平（感量１／１００００ｇ）、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机、低速离心机、纯水器、恒温水浴锅、低温冰箱、酶标仪、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌机等。４．２ 用具培养皿、试管、可调式微量进样器（２μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）及其枪头、研钵、９６孔酶联反应板、离心管（１．５ｍＬ、１０ｍＬ）、ＰＣＲ管（０．２ｍＬ）、量筒、烧杯。５ 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。培养、鉴定苜蓿细菌性萎蔫病菌所用的试剂见附录Ｂ、附录Ｃ并参见附录Ｄ。１犛犖／犜２６６６—２０１０６ 检疫鉴定方法６．１ 常规生物学检测６．１．１ 田间调查及植株检验苜蓿细菌性萎蔫病在田间的典型症状是植株矮化、丛生，叶变小、褪绿，根部维管束组织变褐色。田间调查时采集具可疑症状的植株根、茎带回实验室，用清水冲净，晾干后用干净剪刀剪成１ｃｍ左右的小段，无菌操作下，将各样品用有效氯１％的次氯酸钠做表面消毒１ｍｉｎ～３ｍｉｎ（视材料粗细而定），无菌水清洗３次后，置于无菌空培养皿中，加少量无菌水，用灭菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在改良Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ琼脂培养基（含２５０×１０－６的放线菌酮）平皿上划线分离，２０℃恒温培养５ｄ～７ｄ，观察菌落生长情况。６．１．２ 种子检验依据ＳＮ／Ｔ１８０９的规定随机抽取２５ｇ苜蓿种子（约１００００粒）为一份样品，用电动搅拌机将种子样品打碎，然后悬浮于２５０ｍＬ无菌水中，４℃冰箱过夜；室温下在振荡器上以２５０ｒ／ｍｉｎ振荡３０ｍｉｎ，用ＭＮ６０６１／４滤纸过滤。每毫升滤液中加０．１ｍＬ３７％（质量浓度）甲醛溶液，室温孵育１ｈ。然后以７０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，重新悬浮于２ｍＬ蒸馏水中。将其均分为３份，其中１份做分离培养检验，另２份加１０％甘油保存，分别用做ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ检测实验。将上述菌悬液经倍比稀释（１０－１～１０－５）后，取每个稀释度０．１ｍＬ在改良Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ琼脂培养基平板上分离，重复２次～３次，在２０℃～２２℃培养５ｄ～７ｄ，观察菌落特征。典型菌落特征同６．１。６．１．３ 病原菌的生理生化鉴定将供试菌株悬浮于５０μＬ～１００μＬ蒸馏水，在金氏Ｂ培养基平板上划线，２０℃～２２℃培养５ｄ～７ｄ，观察菌落形态及色素产生情况，然后进行下列生理生化测试，苜蓿萎蔫病菌在金氏Ｂ培养基形成淡黄色、圆形，边缘光滑，有光泽，无荧光的菌落，能产生颗粒状蓝黑色色素。其生理生化特性具体参见表Ａ．１。６．２ 双抗体夹心酶联免疫吸附法检测见附录Ｃ。６．３ 犘犆犚法检测见附录Ｄ。７ 鉴定特征７．１ 常规生物学检测苜蓿细菌性萎蔫病菌在该培养基上可形成淡黄色、圆形、边缘光滑、有光泽、略隆起或扁平的菌落，大多数菌株在７ｄ～１２ｄ后产生典型的蓝黑色色素，颗粒状，该特征可作为鉴定性指标。根据该菌落特征选取可疑菌落做进一步鉴定。７．２ 犇犃犛犈犔犐犛犃检测当待检样品孔和阳性样品孔有颜色反应，阴性对照孔和空白对照孔无颜色反应，且酶标仪检测阴性２犛犖／犜２６６６—２０１０对照的ＯＤ值小于０．１５，则判定检测结果有效。计算待测样品ＯＤ值（Ｐ）与阴性对照ＯＤ值（Ｎ）之比值，若Ｐ／Ｎ大于２，则检测结果判定为阳性；若Ｐ／Ｎ小于２，则检测结果判定为阴性。７．３ 犘犆犚检测观察ＰＣＲ产物的电泳结果时，若供试样品和阳性对照在１３２ｂｐ处有条带出现，阴性对照和空白对照无条带出现，即可判定供试样品为阳性，即供试样品中携带苜蓿细菌性萎蔫病菌；否则为阴性。８ 结果判定在常规生物学方法检测中，如果种植观察出现典型症状的病株、分离到的细菌菌株在选择性培养基上的菌落特征及其生理生化特性与描述相符，可以初步判定为检出苜蓿细菌性萎蔫病菌。在病原血清学检测中，如果ＥＬＩＳＡ法检测结果为阳性，可以初步判定为检出苜蓿细菌性萎蔫病菌。在分子生物学检测中，如果ＰＣＲ法检测结果为阳性，而且扩增的片断大小与描述相符，结合上述两种方法的检测结果，可以最终判定为检出苜蓿细菌性萎蔫病菌。９ 样品保存保存样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出苜蓿细菌性萎蔫病菌的样品应妥善保存于４℃冰箱中以备复核，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。１０ 菌株保存从检测样品中分离到并鉴定为苜蓿细菌性萎蔫病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于金氏Ｂ培养基斜面上，２８℃恒温培养４８ｈ。然后置于４℃冰箱中保存３个～５个月；或用真空冷冻干燥机制成冻干粉，－８０℃下长期保存。１１ 结果记录与资料保存实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有检测人员、审核人员的签字。生物学测定需要有寄主的症状照片、培养菌落照片等，酶联免疫测定要有酶联板反应的照片和原始数据，ＰＣＲ检测需要有电泳结果照片，上述资料应归档并妥善保存。１２ 复核由国家质量监督检验检疫总局指定单位和人员对检测结果进行复核，主要考核实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。３犛犖／犜２６６６—２０１０附 录 犃（资料性附录）苜蓿细菌性萎蔫病菌相关资料犃．１ 英文名称Ｂａｃｔｅｒｉａｌｗｉｌｔｏｆｌｕｃｅｒｎｅ犃．２ 学名犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．犻狀狊犻犱犻狅狊狌狊（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ）Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．１９８４犃．３ 分布地区南非、突尼斯、澳大利亚、新西兰、捷克、希腊、爱尔兰、意大利、波兰、塞尔维亚、罗马尼亚、俄罗斯、英国、斯洛伐克、加拿大、墨西哥、美国、巴西、智利、日本、沙特阿拉伯、土库曼斯坦。犃．４ 寄主范围该病菌自然侵染的寄主有：苜蓿、百脉根、野苜蓿、白香草木樨、红豆草、车轴草属等。犃．５ 病害症状该病在秋季苜蓿收割后重新生长达５ｃｍ～１０ｃｍ高时症状最明显。轻度发病时叶片呈斑驳状，叶缘向上卷曲，植株略变矮。中度症状为茎丛生，有丛簇现象。严重发病时，植株矮化，仅几厘米高，茎细、叶小而厚，通常畸形，边缘或全叶褪色，植株萎蔫而死亡。病株的主根和侧根的本质横切面外圈呈黄褐色，随着病害的发展，整个中柱变色，呈黄褐色。犃．６ 病原菌形态特征及其培养性状苜蓿细菌性萎蔫病菌为短形杆菌，末端圆，单生或成对，大小为（０．４μｍ～０．５μｍ）×（０．７μｍ～１．０μｍ），无鞭毛，不运动，好气，不产酸。在培养基上生长缓慢，生长最适温度为１２℃～２１℃，最高３０℃，最低３℃。该病原菌最明显特点是病菌在含葡萄糖的培养基上能产生具诊断性的蓝黑色颗粒状色素———靛青素（Ｉｎｄｉｇｏｉｄｉｎｅ）。犃．７ 病原菌生理生化特性详见表Ａ．１。４犛犖／犜２６６６—２０１０表犃．１ 苜蓿萎蔫病菌的生理生化特性革兰氏染色＋运动性－Ｋｉｎｇ氏Ｂ培养基产色素试验＋甲基红反应＋产ａｃｅｔｉｏｎ（ＶＰ反应）＋蔗糖还原－尿酶－淀粉水解－利用乳酸盐－产酸反应－鼠李糖－木糖＋半乳糖＋甘露糖＋甘露醇－山梨醇－犃．８ 传播途径该病菌主要靠带菌的苜蓿种子作远距离传播，带菌种子至少保持３年的侵染力。该病菌近距离传播主要通过收割工具、人员、灌溉水、雨水、修枝剪、培养料等，由伤口、气孔和自然孔口侵入寄主组织。该病菌在土壤和病残体组织中可存活３年以上，但一般不超过５年。５犛犖／犜２６６６—２０１０附 录 犅（规范性附录）苜蓿细菌性萎蔫病菌常用培养基、缓冲液配方犅．１ 金氏犅培养基（狆犎７．２）聚蛋白胨 ２０ｇ甘油１０ｍＬＫ２ＨＰＯ４１．５ｇ晾脂粉１５ｇＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犅．２ 改良犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉琼脂培养基（狆犎７．２）（ＮＨ４）２ＳＯ４４ｇＣａＣｌ２０．３３ｇＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０．４ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ０．１８ｍｇ葡萄糖２０ｇ肌醇１ｍｇＫＨ２ＰＯ４１．５ｇＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ２．５ｍｇＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ０．４ｍｇ对氨基苯甲酸５０μｇ烟酸２００μｇＭｇＳＯ４０．５ｇＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ３．１ｍｇＫＩ１０ｍｇＮａ２Ｂ４Ｏ７·１０Ｈ２Ｏ０．８８ｍｇ泛酸钙２００μｇ蒸馏水１０００ｍＬ高压灭菌后，冷却至５０℃时加入：天冬酰胺２ｇ维生素Ｂ１２００μｇ硫酸腺嘌呤４０ｍｇ维生素Ｂ６２００μｇ尿嘧啶２０ｍｇ维生素Ｈ１μｇ放线菌酮０．２５ｇ６犛犖／犜２６６６—２０１０犅．３ 犖犅液体培养基（狆犎７．２）酵母膏１ｇ葡萄糖１０ｇ牛肉浸膏３ｇ蛋白胨５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犅．４ ３７％甲醛溶液甲醛３７ｍＬ蒸馏水６３ｍＬ上述培养基的制备严格按照ＳＮ／Ｔ１５３８．１进行，以确保其质量合格。７犛犖／犜２６６６—２０１０附 录 犆（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫法检测苜蓿细菌性萎蔫病菌犆．１ 试剂犆．１．１ 包被抗体特异性的苜蓿细菌性萎蔫病菌抗体。犆．１．２ 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的苜蓿细菌性萎蔫病菌抗体。犆．１．３ １０×犘犅犛犜缓冲液将氯化钾（ＫＣｌ）２ｇ、氯化钠（ＮａＣｌ）８０ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）２ｇ、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１１．５ｇ、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）５ｍＬ，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至７．４，加蒸馏水定溶至１Ｌ，４℃下贮存。犆．１．４ 样品抽提缓冲液将亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇ、聚乙烯基吡咯烷酮（ＭＷ２４００～４０００，ＰＶＰ）２０ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）２０ｍＬ溶解于１０００ｍＬＰＢＳＴ中，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至７．４，４℃下贮存。犆．１．５ 包被缓冲液将碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ、碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ，溶解于１０００ｍＬ蒸馏水中，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至９．６，４℃下贮存。犆．１．６ 洗涤缓冲液将１×ＰＢＳＴ缓冲液用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至７．４，４℃下贮存。犆．１．７ 酶标抗体缓冲液将１×ＰＢＳＴ缓冲液８００ｍＬ、小牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２ｇ、聚乙烯基吡咯烷酮（ＭＷ２４００～４０００，ＰＶＰ）２０ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ，用无菌蒸馏水定溶至１０００ｍＬ，４℃下贮存。犆．１．８ 底物（犘犖犘犘）缓冲液将二乙醇胺９７ｍＬ、叠氮钠