SNT 5197-2019 牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5197—2019牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程QuarantineprotocolforrealtimePCRoflumpyskindiseasevirus2019-12-27发布2020-07-01实施中华人民共和国海关总署发布ICS11.220B41ISN/T5197—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关。本标准主要起草人：聂福平、李应国、王昱、杨俊、王国民、李贤良、张雷、史梅梅、吴蕊。1SN/T5197—2019牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程1范围本标准规定了牛结节疹病毒的荧光定量PCR检测方法。本标准适用于牛结节疹病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3　缩略语下列缩略语适用于本文件。Bp：碱基对（basepair）CPE：细胞病变效应法（cytopathiceffect）Ct：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）LSDV：牛结节疹病毒（lumpyskindiseasevirus）PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）Taq酶：DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4　原理采用TaqMan荧光定量PCR方法，通过比对牛结节疹病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒的保守基因，针对ITR区域设计一对仅在牛结节疹病毒基因保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记MGB探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R），3’端标记的MGB荧光素（Q）在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。2SN/T5197—20195设备和试剂5.1主要仪器和设备5.1.1荧光定量PCR仪。5.1.2低温高速离心机、微量高速离心机。5.1.3低温冰箱。5.1.4微型振荡器。5.1.5生物安全柜。5.1.6恒温水浴锅。5.1.7高压灭菌锅。5.1.8微量可调移液器。5.2试剂、耗材5.2.1营养液：配制方法见A.1。5.2.2维持液：配制方法见A.2。5.2.3细胞分散液：配制方法见A.3。5.2.4商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒。5.2.5PremixExTaq（ProbeqPCR）荧光PCR缓冲液。5.2.6引物：根据牛结节疹病毒（LSDV）国际标准株基因序列，在其最保守的ITR区序列设计合成一对特异性引物，F:5’-TTGTCAGAAACGAGG-3’，R:5’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3’和一条MGB探针[（FAM）5’-TCTTGCTAAAATACCA-3’（MGB）]配制成10μmol/L，-20℃保存。注：以上所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水应符合GB/T6682中规定的三级水的规格。5.3标准毒株和细胞5.3.1标准毒株：以LSDV国际标准毒株Neethling株为试验的参照毒株。5.3.2细胞：按照常规方法取健康羔羊睾丸，制备原代睾丸细胞；或采用MDBK细胞、Vero细胞。6对照样品制备6.1阳性对照样品由牛结节性皮肤病参考实验室提供或按照下列方法制备：将牛结节疹国际标准毒株（5.3.1）按10%接种原代睾丸细胞（5.3.2），于37℃吸附1h后加入维持液（5.2.2），37℃5%CO2培养，待CPE达到70%时收获病毒悬液：冻融3~4次，5000r/min离心10min，取上清液备用。也可以用含LSDVITR扩增区DNA序列的质粒作为阳性对照。6.2阴性对照样品由牛结节性皮肤病参考实验室提供或按照下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞冻融3~4次，5000r/min离心10min，取上清液备用。7操作方法7.1样品的处理7.1.1所有的实验操作应符合GB19489、GB/T27401和GB/T27403的相关要求，在生物安全二级及以上实验室进行实验。3SN/T5197—20197.1.2组织样品：包括皮肤、肺、脾脏、淋巴结、肌肉等。取2g~5g组织样品切成小块，加入5mL~10mL预冷的PBS缓冲液匀浆2min，制成悬液，反复冻融3次，4℃5000r/min离心10min，取200μL上清液进行核酸提取。7.1.3血液样品：不需进行特殊处理，直接取200μL进行核酸提取。7.2病毒DNA的提取和纯化取阴阳性对照样品及按照7.1.2和7.1.3处理的样本各200μL，在生物安全柜中，按照商品化微量病毒核酸提取试剂盒操作说明要求提取病毒DNA。7.3荧光定量PCR检测7.3.1荧光PCR反应体系检测牛结节疹病毒荧光定量PCR反应体系见表1。以牛结节疹病毒DNA作为阳性对照，以不含LSDV的牛肉组织、原代睾丸细胞DNA作为阴性对照，以水作为空白对照。表1荧光定量PCR反应体系名称贮备液浓度体系工作液浓度加样数量/μLPremixExTaq缓冲液2×0.8×8正向引物10μmol/L0.5μmol/L1反向引物10μmol/L0.5μmol/L1MGB探针10μmol/L0.2μmol/L0.4模板DNA——2灭菌去离子水——7.6反应体系总体积——20注：荧光定量PCR反应体积可根据实际情况进行相应比例的调整。7.3.2荧光PCR反应参数PCR检测的循环参数：95℃预变性30s，95℃5s、60℃34s，共40个循环，60℃34s收集FAM荧光信号。8结果判定8.1结果分析8.1.1读取检测结果，阈值设定原则以阈值线超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。8.1.2不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准阴性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的Ct值应小于28.0。4SN/T5197—20198.3结果判定8.3.1阳性Ct值小于等于35，而且出现明显的扩增曲线，判定样品中存在牛结节疹病毒核酸。8.3.2阴性无特异性扩增曲线或Ct值大于40，判定样品中无牛结节疹病毒核酸。8.4临界值有效判定原则35.0＜Ct值≤40.0的样本应重做，重做结果无Ct值且无明显扩增曲线则为阴性，而有Ct值且有明显扩增曲线则为阳性。5SN/T5197—2019附录A（规范性附录）试剂配制A.1营养液DMEM培养基加10%无LSDV抗体犊牛血清，内含青霉素200IU/mL、链霉素200IU/mL，抽滤除菌。A.2维持液DMEM培养基加2%无LSDV抗体犊牛血清，内含青霉素200IU/mL、链霉素200IU/mL，抽滤除菌。A.3细胞分散液胰酶2.50g乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g无钙镁PBS1000mL抽滤除菌，-20℃保存备用。6SN/T5197—2019附录B（资料性附录）牛结节疹病毒特异性片段序列CCACCCCAATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAATCACTGCACATGATTCCCTAATGTSN/T5197—2019中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编辑部：[phone]网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数24千字2019年月第一版2019年月第一次印刷印数1—500书号：155175·2定价21.00元牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程行业标准SN/T5197—2019SN/T5197—2019***