TCVMA 1-2018 禽白血病净化技术规范

ICS11.220B41团体标准T/CVMA1—2018禽白血病净化技术规范TechnicalspecificationsforeradicationofAvianLeukosis2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA1—2018I前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、山东农业大学、扬州大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：王传彬、赵鹏、翟新验、杨林、王笑梅、秦爱建、蒋菲、刘林青、宋晓晖、高玉龙、钱琨、顾小雪、刘玉良、叶建强、刘洋、曲萍、王睿男、毕一鸣、徐琦。T/CVMA1—20181禽白血病净化技术规范1范围本标准规定了种鸡群禽白血病净化检测和净化状态维持相关的技术规范。本标准所列种鸡各生长阶段净化检测技术主要适用于有禽白血病净化需求的原种鸡群（或称核心群），其他类型鸡群也可参照执行。所列禽白血病净化状态维持技术适用于已实现禽白血病净化的鸡群。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18635动物防疫基本术语GB/T26436禽白血病诊断技术NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法《中国兽药典》3术语和定义GB/T18635确定的及下列术语和定义适用于本文件。3.1种鸡breedingchicken经过不断选种、选育，按育种组织制订的标准鉴定承认的鸡品种，按经济用途分为蛋用型、肉用型、肉蛋兼用型和观赏型。3.2原种鸡群pedigreebreederflock按照四系配套原则，鸡的遗传谱系分为曾祖代、祖代、父母代、商品代，只有曾祖代的鸡可以自繁留种，其他后代都不能留做和它同级的种，通常将曾祖代称为原种鸡群或者核心群。3.3动物疫病净化animaldiseaseeradication有计划地在特定区域或场所对特定动物传染病通过监测、检验检疫、隔离、扑杀、销毁等一系列技术和管理措施最终达到在该范围内动物个体不发病和无感染状态的根除消灭疫病病原的过程，目的是清T/CVMA1—20182除可传染的病原因子，从而达到并维持动物个体和群体健康。这个特定区域或场所是人为确定的一个固定范围，可以是一个养殖场、一个自然区域、一个行政区，也可以是一个国家。本标准所指净化主要指在种鸡群中（通常为一个种鸡场），通过雏鸡胎粪检测、不同日龄鸡血液病毒分离、公鸡精液中病毒分离等方法，发现并淘汰鸡群中感染禽白血病的鸡只，最终达到鸡群消除该病的过程。4净化检测程序4.1出壳雏鸡胎粪检测与淘汰4.1.1将种蛋置于出壳纸袋（纸盒）中隔离孵化，每只（羽）种鸡所产种蛋单独使用一个出壳纸袋（纸盒），以免出雏时发生横向传播。4.1.2出壳后将雏鸡胎粪挤压于灭菌的1.5mL离心管中，离心管中预先加入0.5mL样品稀释液（含体积分数10%新生牛血清的PBST溶液或商品化试剂盒中专用稀释液），充分震荡混匀。对一只（羽）母鸡的雏鸡采集完胎粪后，更换一次性手套或对双手信息消毒后，方可采集下一只（羽）母鸡的雏鸡胎粪。4.1.3将雏鸡胎粪样品置入液氮中快速冷冻后取出，放入37℃水浴锅中融化，反复冻融三次，使禽白血病病毒p27抗原充分释放，离心取上清液用于检测胎粪中禽白血病病毒p27抗原。4.1.4禽白血病病毒p27抗原检测，可按照NY/T680标准或采用等效的商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒进行，也可采用针对禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体建立的胶体金试纸条等快速检测方法。4.1.5同一只（羽）母鸡所产的雏鸡中，若有一只（羽）雏鸡胎粪检测为禽白血病病毒p27抗原阳性，则该纸袋（纸盒）中所有雏鸡视为阳性，相应雏鸡及其对应母鸡应全部淘汰。4.1.6阴性鸡作为育种选留进行隔离饲养，同一母鸡的阴性雏鸡放于同一笼中。在育雏期间每个笼具之间应采取阻隔措施以避免水平传播，避免笼间直接接触和直接气流的对流。可在每个笼具之间用纸板阻隔，在不影响通风情况下纸板高度应尽量高。4.2育雏后期的检测与淘汰4.2.1在育雏结束即将转入育成鸡舍前，对每只鸡无菌采集抗凝血，按照GB/T26436规定程序接种DF-1细胞进行病毒分离，培养9天（d）后取细胞培养上清，按4.1.4规定方法检测禽白血病病毒p27抗原。4.2.2检测为阳性的鸡应淘汰，不再作为育种选育个体。对检测为阴性的选留后备种鸡，应维持小群隔离饲养。4.3开产初期的检测与淘汰4.3.1每只（羽）母鸡取开产后的初产蛋2～3枚采集蛋清，蛋清反复冻融三次，按照4.1.4规定方法逐个检测禽白血病病毒p27抗原。也可无菌采集母鸡抗凝血，按照4.2.1规定方法进行禽白血病病毒分离鉴定。4.3.2公鸡分别采集抗凝血和精液同时接种DF-1细胞，按照4.2.1规定方法进行禽白血病病毒分离鉴定。精液病毒分离鉴定具体操作见附录A。4.3.3检测为阳性的鸡应淘汰，不再作为育种选育个体。对检测为阴性的选留后备种鸡，继续维持小群隔离饲养。T/CVMA1—201834.4留种前的检测与淘汰4.4.1取每只（羽）母鸡所产种蛋2～3枚采集蛋清，检测方法同4.3.1。4.4.2公鸡检测方法同4.3.2。4.4.3检测为阳性的鸡应淘汰，不再作为育种选育个体。对检测为阴性的选留后备种鸡，继续维持小群隔离饲养。4.5种蛋的选留和孵化按照本标准4.1～4.4规定程序淘汰所有阳性鸡后，每只母鸡仅选用1只检测为阴性公鸡的精液进行人工授精。按育种规定时间留足种蛋，每只母鸡的种蛋均标号。将每只母鸡的种蛋置于写有该母鸡标号的专用孵化纸袋（纸盒）中，防止不同母鸡的种蛋直接接触，置于出雏箱中出雏。4.6不同世代的持续检测经检测合格的种蛋孵出的雏鸡作为净化后第二世代鸡，继续按照本标准4.1～4.5规定的程序实施第二世代的检测和净化。后续世代按此程序继续循环进行，直至评估达到附录B所列禽白血病净化评估标准。5净化周期与终止5.1净化周期确定净化时可根据种鸡所处育种时期，对照本标准4.1～4.5的任何一个时间节点启动净化程序。不同种鸡场可根据其技术条件分别选择本标准4.1～4.5的任何一时间节点进行检测，但按照本标准4.1～4.5从出壳开始至留种过程中所有时间节点全部进行检测是实现净化的最短周期。5.2净化效果评估净化效果评估应按照国家农业行业行政主管部门制定的禽白血病净化评估程序和净化评估标准进行。净化评估标准见附录B。5.3达到净化鸡群的检测比例调整对按照5.2评估达到净化标准的原种场无需再按照本标准4.1～4.5要求进行普遍性检测，可按照5.2或不低于10%的比例进行抽样监测。检测结果不符合5.2所要求标准，则按照本标准4.1～4.5所列检测规程重新进入检测净化程序。6已净化鸡群的净化状态维持措施6.1种源的选择对饲养进口祖代及其以下代次的鸡场，应从无外源性禽白血病病毒感染的育种公司购入苗鸡。应要求供应商提供初产种蛋(100～200枚)，检测蛋清中p27抗原为阴性。同时，可要求供应商提供相关种鸡群在相应年龄（23周龄后）的禽白血病病毒血清抗体检测报告和留种孵化前所产种蛋的蛋清p27抗原检测报告。禽白血病病毒血清抗体检测，可采用针对禽白血病病毒p27蛋白抗体的ELISA检测方法，同时也T/CVMA1—20184可采用针对禽白血病A/B亚群和J亚群抗体的商品化ELISA试剂盒检测。禽白血病病毒p27蛋白抗体的ELISA检测操作程序见附录C6.2鸡群禽白血病病毒感染状态监测种鸡群在饲养过程中应进行禽白血病定期监测，以了解鸡群禽白血病病毒的感染状态。可在种鸡群开产后、留种蛋前，采集500份左右血清样品，用ELISA方法检测禽白血病病毒A/B亚群及J亚群抗体或p27蛋白抗体。同时，采集种蛋用ELISA方法检测蛋清中的禽白血病p27抗原。如果血清抗体阳性率或蛋清p27抗原阳性率超过1%时，应对鸡群采集抗凝血接种DF-1细胞进行病毒分离鉴定。6.3鸡群之间水平传播的预防种鸡场应执行全进全出制度。饲养已经净化的品系时，应避免不同来源的种鸡在同一鸡场饲养而发生交叉感染。一个鸡场在同一时期只能饲养同一批来源的种鸡。不同来源的种蛋在孵化和出雏之时应分开，避免与其他鸡群（特别是非净化鸡群）同时孵化和出壳，以减少禽白血病水平传播风险。6.4生物安全措施的建立种鸡场地理位置应相对隔离，远离其他鸡场。运送物品车辆以及人员出入，均应执行消毒制度，同时应尽可能降低种鸡场所需物品与外界的交流。接触核心群的工作人员应固定化，避免其他鸡群的饲养员进入实施净化的鸡群中工作。种鸡场应在鸡舍安装防鸟网或其他防鸟设施，并定期检查维护。6.5疫苗的管理和使用净化鸡群使用的针对各种鸡病的弱毒疫苗，应是经过《中国兽药典》规定程序检测合格的疫苗，确保无外源性禽白血病毒污染。用鸡胚或鸡胚来源的细胞作为原材料生产的疫苗，以及对1日龄雏鸡通过注射法（包括皮肤刺种）使用的疫苗，使用前应进行检测。鸡用弱毒活疫苗中禽白血病病毒污染检测操作程序可参考附录D。T/CVMA1—20185附录A（规范性附录）公鸡精液中病毒分离鉴定操作程序A.1使用75%乙醇将泄殖腔周围擦拭干净，将公鸡精液采集到1.5mL已灭菌的离心管中，一只公鸡的精液对应一个离心管，编号后放入冰盒中暂存。采集的精液，用含有青链霉素（青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL）的细胞维持液，按照最终稀释度为1:28～1:56充分混匀后接种DF-1细胞，在37℃，5%CO2条件下培养2小时（h）后换为正常细胞维持液。A.2上述细胞在37℃，5%CO2条件下培养7d～9d，取出冻融一次，然后分别取0.1mL细胞培养上清按照NY/T680或等效商品化试剂检测禽白血病病毒p27抗原，如检测结果阳性，则判定所检测公鸡精液中存在外源性禽白血病病毒。T/CVMA1—20186附录B（资料性附录）《动物疫病净化示范场评估标准（试行）》（2017版）中有关禽白血病净化评估标准B.1净化评估标准同时满足以下要求，视为达到净化标准：——种鸡群抽检，禽白血病病原学检测均为阴性；——连续两年以上无临床病例；——现场综合审查通过。B.2抽检要求表B.1净化评估抽样检测方法检测项目检测方法抽样种群抽样数量样本类型病原学检测p27抗原ELISA产蛋鸡群500枚种蛋（随机抽样，覆盖不同栋鸡群）种蛋病毒分离（DF-1细胞）种鸡群单系50份（随机抽样，覆盖不同栋鸡群）血样注：p27抗原检测全部为阴性，实验室检测通过；p27抗原检测阳性率高于1%，实验室检测不通过。检出p27抗原阳性且阳性率1%以内，采用病毒分离进行复测，病毒分离全部为阴性，实验室检测通过；病毒分离出现阳性，实验室检测不通过。T/CVMA1—20187附录C（资料性附录）禽白血病病毒p27蛋白抗体ELISA检测操作程序C.1仪器设备酶标仪（含450nm波长滤光片）、50μL和100μL的精确微量移液器、200μL八或十二通道可调移液器、一次性移液器吸头、稀释用96孔板、37℃孵育箱、1000mL量筒（配制洗涤液用）、蒸馏水或去离子水、自动或手动洗板系统等。C.2材料禽白血病p27抗体ELISA检测试剂盒。C.3操作C.3.1样品采集经翅静脉采血，分离血清，要求血清清亮、无溶血。短期内使用可置于4℃保存，否则应置于-20℃以下冻存。C.3.2试剂盒检测C.3.2.1检测原理本试剂盒使用纯化的p27蛋白包被微量反应板，利用间接ELISA原理进行检测。如果待测样品中含有针对ALV-p27的抗体，则与包被抗原结合，加入可与鸡抗体结合的酶标二抗（酶结合物）后，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，再加入TMB底物液作用显色，在酶标仪450nm波长测定各孔吸光度值，判定结果。C.3.2.2洗涤液的配制使用前，浓缩的10×洗涤液应恢复至室温（25℃左右），并摇动使沉淀的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释（例如：每板用40mL浓缩液加360mL水），即1×洗涤液。C.3.2.3样品